桑葉降糖活性物質(zhì)dnj分離純化及其體外藥理活性研究

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1、廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所呈交的學(xué)位論文，是個人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下，獨(dú)立進(jìn)行研究工作所取得的成果。除文中已經(jīng)特別加以注明引用的內(nèi)容外，本論文不含任何其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的作品成果。對本文的研究做出重要貢獻(xiàn)的個人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明并致謝。本人完全意識到本聲明的法律結(jié)果由本人承擔(dān)。學(xué)位論文作者簽名塑日期：己。l午年r月710FI關(guān)于學(xué)位論文使用授權(quán)的聲明本人完全了解廣州中醫(yī)藥大學(xué)有關(guān)保留使用學(xué)位論文的規(guī)定，同意學(xué)校保留或向國家有關(guān)部門機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子

2、版，允許被查閱和借閱。本人授權(quán)廣')'Hrll醫(yī)藥大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或其他復(fù)印手段保存和匯編本學(xué)位論文。(保密論文在解密后應(yīng)遵守此規(guī)定)論文作者簽名塾!望論文導(dǎo)師簽名日期：zol(f年F月摘要目的：1．采用高效液相色譜一蒸發(fā)光檢測(HPLC—ELSD)法建立一種穩(wěn)定、可靠、重現(xiàn)性好的桑葉生物堿DNJ(卜脫氧野尻霉素)含量測定方法；并且以DNJ含量為評價指標(biāo)，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，運(yùn)用響應(yīng)面分析法(ResponseSurfaceMethodo

3、logy)優(yōu)選桑葉生物堿提取工藝：2．以DNJ含量為評價指標(biāo)，篩選分離純化桑葉生物堿效果最優(yōu)的陽離子交換樹脂，并考察其上柱液流速、洗脫液濃度及洗脫液流速等影響因素，進(jìn)而得到最佳分離純化工藝：3．考察桑葉生物堿對淀粉酶、蔗糖酶和麥芽糖酶體外抑制活性試驗(yàn)方法；同時，進(jìn)行酶活性抑制反應(yīng)條件優(yōu)化及酶動力學(xué)研究，考察桑葉生物堿對其酶活性抑制藥理活性。方法：1．采用高效液相色譜一蒸發(fā)光檢測(HPLC—ELSD)法建立桑葉中生物堿含量檢測方法，通過單因素及響應(yīng)面分析法實(shí)驗(yàn)，考察乙醇濃度、pH值、料液比及浸提時間

4、4個因素對提取率的影響，得到桑葉生物堿的最佳提取工藝；2．以DNJ生物堿含量為評價指標(biāo)，進(jìn)一步篩選出分離純化效果最佳的樹脂類型；通過考察上柱液流速、洗脫液濃度及洗脫液流速等三個因素，得到桑葉生物堿最佳分離純化工藝：3．體外模擬Q一葡萄糖苷酶反應(yīng)體系，應(yīng)用三種Q一葡萄糖苷酶，即淀粉酶、蔗糖酶和麥芽糖酶試劑盒，分別進(jìn)行桑葉生物堿的酶活力抑制率測試實(shí)驗(yàn)，利用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)做圖法，進(jìn)一步確定最佳反應(yīng)體系及酶抑制動力學(xué)類型。結(jié)果：1．采用HPLC-ELSD法，以DIKMAPlatisi

5、lNH2(4．6mm×250ram，5um)為色譜柱，流動相為乙腈一水(90：10)、流速為1．Oml·min-1、ELSD漂移管溫度40℃、及載氣流速為3．5×105Pa等條件建立生物堿含量測定方法；方法學(xué)考察結(jié)果顯示0．3562．8481．tg·mL。1范圍內(nèi)質(zhì)量濃度與峰面積呈良好線性關(guān)系、同時精密度RSD=O．54％、穩(wěn)定性RSD=O．98％、重現(xiàn)性RSD=I．46％、平均加樣回收RSD=2．75％等各項(xiàng)指標(biāo)均顯示此種方法不止精密度高，穩(wěn)定性和重現(xiàn)性優(yōu)，且加樣回收率亦顯示此種方法可行：采用H

6、PLC-ELSD方法來測定桑葉生物堿的含量，確定桑葉生物堿提取的最佳工藝參數(shù)為乙醇濃度66．53％、pH值為6．66、浸提時間2．73h；在此條件下，桑葉生物堿實(shí)際提取量為0．1946％，較以前的文獻(xiàn)研究提取量有明顯提高，并且通過3次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果顯示桑葉生物堿DNJ平均提取量為0．1967％，RSD為0．23％。2．通過工藝考察，篩選出001×7型陽離子交換樹脂作為分離生物堿的樹脂類型。其最佳分離工藝為：上樣液生物堿濃度1．75mg’IⅡL～、洗脫液濃度為氨水乙醇濃度(80：20)、洗脫液流

7、速1．5m]／min進(jìn)行洗脫效果最佳，經(jīng)001×7型陽離子交換樹脂處理后的桑葉生物堿DNJ在浸膏中含量可達(dá)29％以上，并且通過方法學(xué)考察實(shí)驗(yàn)得到此工藝精密度高，重復(fù)性及可操作性強(qiáng)。3．體外活性試驗(yàn)表明，桑葉DNJ抑制三種Q一葡萄糖菅酶活性作用中，其僅對蔗糖酶的抑制作用顯著，并且隨著DNJ濃度增加抑制率呈正相關(guān)遞增；考察最佳反應(yīng)體系實(shí)驗(yàn)表明在酶用量為20pL、反應(yīng)時間為llmin和55mg·mL’1底物濃度時為最佳反應(yīng)條件；另外，Lineweaver-Burk雙倒數(shù)做圖法結(jié)果顯示DNJ提取物對蔗糖酶

8、抑制反應(yīng)類型為非競爭性抑制。結(jié)論：l-HPLC—ELSD法建立的測定桑葉生物堿方法結(jié)果重現(xiàn)性好，穩(wěn)定可行；2．稀酸稀醇溶媒浸提桑葉生物堿的二次多項(xiàng)數(shù)學(xué)模型，說明根據(jù)Box—Behnken模型、采用響應(yīng)面分析法得到的桑葉DNJ提取優(yōu)化工藝準(zhǔn)確可靠；3．001X7型陽離子交換樹脂能夠用于分離純化桑葉生物堿，且效果佳得率高；4．桑葉生物堿DNJ對蔗糖酶活性抑制明顯，且為非競爭性抑制。關(guān)鍵宇：桑葉；生物堿；DNJ；響應(yīng)面分析法；陽離子交換樹脂；Ⅱ一葡萄糖苷酶；酶活力抑制率ⅡIsoIatio