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1、Westernblotprotocol步驟：1.分離膠和積層膠，制膠板；注意：灌分離膠時不要加太多。2.蛋白變性：準備蛋白樣本，加入等體積的2×上樣Buffer稀釋，置于沸水中煮10min（預染marker煮5min）3.加樣：每孔加入20～40μl樣品4.電泳：置于電泳槽中電泳45min，恒定電流90mA（2塊板），如為1塊板則電流為50mA；5.取出膠板，用切割刀修好膠；6.將膠置于轉(zhuǎn)膜液中浸泡；7.按順序放好下列物質(zhì)：黑面→海綿→濾紙→膠→NC膜→濾紙（用吸管趕去氣泡）→海綿；8.置于轉(zhuǎn)膜槽中于，黑面對黑面，加上冰塊，加入轉(zhuǎn)膜液；9.裝好電極，于恒定電壓100V
2、下，90min；10.麗春紅染膜；11.用TBST洗去麗春紅；12.封閉：加入5％脫脂奶粉＋TBST，常溫搖床搖1h；13.回收封閉液，加入一抗【一抗用5％BSA＋TBS稀釋】；14.置于4℃搖床搖過夜；15.回收一抗，TBST洗膜，10min，共3次；16.加入二抗【二抗用5％脫脂奶粉＋TBS稀釋】，常溫搖床搖1h；17.回收二抗，TBST洗膜，10min，共3次；18.將膜置于發(fā)光液中浸泡約1min；19.將膜鋪于曝光盒中，于暗室中曝光，洗膠片。常用溶液配制：Ⅰ細胞裂解液（PLCLysisBuffer）Finalconcentration100ml500ml1MH
3、epes(pH7.5)50mM5ml25ml5MNaCl150mM3ml15mlGlycerol10%10ml50ml50mMMgCl21.5mM3ml15mlTriton×1001%1ml5ml0.5MEDTA(pH8.0)1mM200μl1ml0.1MNaPPi10mM10ml50ml0.5MNaF10Mm2ml10ml每次提取蛋白前加入1％蛋白酶抑制劑Ⅱ.SDS-PAGE膠配方及其它常用溶液的配制1．30%丙烯酰胺丙烯酰胺29gN-N’-亞甲雙丙烯酰胺1g溶于總體積為60ml的水中，加熱至37℃使其溶解，補加水至終體積為100ml。用Nalgene濾器（0.45
4、μm孔徑）過濾除菌或Whatman1號濾紙過濾，查證該溶液的pH值不大于7.0，置棕色瓶中保存于RT。注：（1）丙烯酰胺是強烈的神經(jīng)毒素，可經(jīng)皮膚吸收，丙烯酰胺的作用具累積性。（2）稱取時，必須戴手套、口罩；取溶液時也要戴手套。（3）貯存期間，丙烯酰胺和雙丙烯酰胺緩慢轉(zhuǎn)化為丙烯酸和雙丙烯酸，這一脫氨反應是光催化和堿催化的。應檢查丙烯酰胺溶液的pH值是否在7.0或更低，并應在RT下避光保存。每隔數(shù)月應重新配制溶液。2．3MTris-HCl,pH8.8（用于分離膠）Tris堿分子量為121.1。將72.66gTris堿溶于重蒸水（不超過200ml）中，加濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至8
5、.8，讓溶液泠卻至RT，再最終調(diào)至所需pH值。加重蒸水定容至200ml，1.034×105Pa，20min高壓滅菌，RT貯存。注：(1)如溶液呈現(xiàn)黃色，應予丟棄，并置備質(zhì)量更好的Tris.(2)Tris溶液的pH值因溫度而異，溫度每升高1℃，pH值大約降低0.03個單位。3．2MTris-HCl,pH6.8（用于積層膠）同上方法，將48.44gTris堿加重蒸水定容至200ml，加濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至6.8。4．10%十二烷基硫酸鈉（SDS）在900ml水中溶解100g電泳級SDS，加熱至68℃助溶，加入幾滴濃鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.2，加水定容至1L，分裝備用。注：S
6、DS的微細晶粒易于擴散，因此稱量時要戴面罩，稱量完畢后要清除殘留在稱量工作區(qū)和天平上的SDS，10%SDS溶液無須滅菌。5．TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)TEMED通過催化過硫酸銨形成自由基而加速丙烯酰胺與雙丙烯酰胺的聚合。由于TEMED只能以游離堿的形式發(fā)揮作用，因此pH值較低時聚合反應受到抑制。6．10%過硫酸胺過硫酸胺提供驅(qū)動丙烯酰胺和雙丙烯酰胺聚合所必需的自由基。可用去離子水配制小量10%（W/V）的貯存液于保存于4℃。由于過硫酸銨會緩慢分解，故應隔新鮮配制。方法：把1gAPS溶解于終量為10ml水溶液中，4℃保存數(shù)周。7.電泳緩沖液SDSbu
7、ffer:10X（runningbuffer）Trisbase30.3gGlycine144.0gSDS10.0gddH2Oto1L(1Xconc:25mMTrisbase,192mMglycine,0.1%SDS,)8.轉(zhuǎn)膜緩沖液TransferBuffer(10×)pH8.3Trisbase30.3gGlycine144.0g20%v/vmethanol(Fresh!)ddH2Oto1L(1Xconc:25mMTrisbase,192mMglycine,200mlmethanol)9.TBST(10X)pH:7.5Trisbase24.2gNaC
