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1、.WesternBlot詳解(原理、分類、試劑、步驟及問題解答)Western免疫印跡（WesternBlot）是將蛋白質轉移到膜上，然后利用抗體進行檢測。對已知表達蛋白，可用相應抗體作為一抗進行檢測，對新基因的表達產物，可通過融合部分的抗體檢測。本文主要通過以下幾個方面來詳細地介紹一下WesternBlot技術:一、原理二、?分類i.放射自顯影ii.底物化學發(fā)光ECLECFiv.底物DAB呈色三、?主要試劑四、?主要步驟五、?.實驗常見的問題指南1.參考書推薦2.針對樣品的常見問題3.抗體4.濾紙、膠和膜的問題5.Marker的相關疑問6.染色的選擇7.參照的疑問
2、8.緩沖液配方的常見問題9.條件的摸索10.方法的介紹11.結果分析一、?原理與Southern或Northern雜交方法類似，但WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質，“探針”是抗體，“顯色”用標記的二抗。經過PAGE分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術也廣泛應用于檢
3、測蛋白水平的表達。二、分類現常用的有底物化學發(fā)光ECL和底物DAB呈色，體同水平和實驗條件的是用第一種方法，目前發(fā)表文章通常是用底物化學發(fā)光ECL。只要買現成的試劑盒就行，操作也比較簡單，原理如下（二抗用HRP標記）：反應底物為過氧化物+魯米諾，如遇到HRP，即發(fā)光，可使膠片曝光，就可洗出條帶。?.三、主要試劑1、?丙烯酰胺和N，N’-亞甲雙丙烯酰胺，應以溫熱(以利于溶解雙丙稀酰胺)的去離子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亞甲雙丙烯酰胺儲存液丙稀酰胺29g，N，N-亞甲叉雙丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。)儲于棕色瓶，4℃避光保存。嚴
4、格核實PH不得超過7.0，因可以發(fā)生脫氨基反應是光催化或堿催化的。使用期不得超過兩個月，隔幾個月須重新配制。如有沉淀，可以過濾。2、?十二烷基硫酸鈉SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O去離子水配制，室溫保存。3、?分離膠緩沖液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀釋到100ml終體積。過濾后40C保存。4、?濃縮膠緩沖液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于40mlH2O中，用約48ml1mol/LHCL調至pH6.8加水稀釋到100ml
5、終體積。過濾后40C保存。這兩種緩沖液必須使用Tris堿制備，再用HCL調節(jié)PH值，而不用Tris.CL。5、?TEMED原溶液N，N，N’N’四甲基乙二胺催化過硫酸銨形成自由基而加速兩種丙稀酰胺的聚合。PH太低時，聚合反應受到抑制。10%(w/v)過硫酸胺溶液。提供兩種丙稀酰胺聚合所必須的自由基。去離子水配制數ml，臨用前配制.6、?SDS-PAGE加樣緩沖液:pH6.80.5mol/LTris緩沖液8ml，甘油6.4ml，10%SDS12.8ml，巰基乙醇3.2ml，0.05%溴酚藍1.6ml，H2O.32ml混勻備用。按1:1或1:2比例與蛋白質樣品混合，在沸
6、水終煮3min混勻后再上樣，一般為20-25ul，總蛋白量100μg。7、?Tris-甘氨酸電泳緩沖液:30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸餾水溶解至1000ml，得0.25mol/LTris-1.92mol/L甘氨酸電極緩沖液。臨用前稀釋10倍。8、?轉移緩沖液：配制1L轉移緩沖液，需稱取2.9g甘氨酸、5.8gTris堿、0.37gSDS，并加入200ml甲醇，加水至總量1L。9、?麗春紅染液儲存液：麗春紅S2g三氯乙酸30g磺基水楊酸30g加水至100ml用時上述儲存液稀釋10倍即成麗春紅S使用液。使用后應予以廢棄。10、?脫脂奶粉5%(w/
7、v)。11、?NaN30.02%疊氮鈉(有毒，戴手套操作)，溶于磷酸緩沖鹽溶液(PBS)。12、?Tris緩沖鹽溶液(TBS):20mmol/LTris/HCL(pH7.5)，500mmol/LnaCl。13、?Tween20(15)鼠抗人-MMP-9(16)鼠抗人-TIMP-1。14、?過氧化物酶標記的第二抗體。15、?NBT(溶于70%二甲基甲酰胺，75mg/ml)。16、?BCIP(溶于100%二甲基甲酰胺，50mg/ml)。17、?100mmol/LTris-HCL(pH9.5)。18、?100mmol/LNaCl。19、?50mmol/LTris-HC
