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1、Western-blot詳細(xì)操作過程————————————————————————————————作者：————————————————————————————————日期：WesternBlotWesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄（NC）膜或聚偏二氟乙烯（PVDF）膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的
2、第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達(dá)。流程：蛋白樣品的提取→蛋白樣品定量與變性→PAGE凝膠電泳→轉(zhuǎn)膜→麗春紅染色→封閉→抗體孵育→底物顯色。實(shí)驗(yàn)器材和試劑：一．蛋白提取試劑1.10%SDS裂解液：稱取10gSDS粉末加入雙蒸水至90mL，充分溶解，定容至100ml室溫保存。2.RIPA裂解液1ml裂解液工作液配方：10ul100mmol/LPMSF(1mM)0.2ul10mg/mlAprotinin(2ug/ml)試劑盒RIPA5.0ul1mg/mlLeupeptin(5ug/ml)0.98
3、48ml裂解液0.5ml裂解液工作液配方：5ul100mmol/LPMSF(1mM)0.1ul10mg/mlAprotinin(2ug/ml)2.5ul1mg/mlLeupeptin(5ug/ml)0.4924ml裂解液PMSF必須搖勻至無結(jié)晶時(shí)才可與裂解液混合3．蛋白酶抑制劑：100mmol/LPMSF：17.4mgPMSF粉末溶于1ml異丙醇(AR)，分裝250ul每管后－20℃保存。使用終濃度為1mmol/L。【PMSF：在溶液中不穩(wěn)定，應(yīng)在臨用前從儲存液中現(xiàn)加于裂解液中。PMSF劇毒，嚴(yán)重?fù)p害呼吸道粘膜、眼睛及皮膚，吸入、吞進(jìn)或通過皮膚吸收后有致命危險(xiǎn)一旦
4、眼睛或皮膚接觸了PMSF，應(yīng)立即用大量的水沖洗。凡被PMSF污染的衣物應(yīng)予丟棄?！慷鞍锥吭噭?.BCA蛋白定量試劑盒2.10ml0.9%的生理鹽水（90mgNaCl溶于10ml去離子水中）三．上樣用試劑：6×SDS上樣緩沖液：取一個(gè)離心管，秤取2.0gSDS粉末，6mg溴酚藍(lán)(BromopHenolblue;Albutest)粉末，然后用槍頭加入5mL1.5mol/LTris-HCl(pH6.8)，用移液管加入10mLGlycerol(甘油，丙三醇)，槍頭加入2mLβ-mercapteethanol（β-巰基乙醇）充分混勻，加雙蒸水定容至20ml，渦旋溶解
5、。4℃避光保存。四．電泳工作液：1.1.5mol/LTris-HCl緩沖液：（三（羥甲基）氨基甲烷）稱取18.171gTris粉末，加入60mL雙蒸水中，加鹽酸調(diào)節(jié)pH至6.8或8.8，定容至100mL。4℃保存?？芍掳?，不要直接接觸皮膚。2.1.0mol/LTris-HCl緩沖液：稱取12.114gTris粉末，加入60mL雙蒸水中，加鹽酸調(diào)節(jié)pH至6.8或8.8，定容至100mL。4℃保存?？芍掳灰苯咏佑|皮膚。3.0.5mol/LTris-HCl緩沖液：稱取6.057gTris粉末，加入60mL雙蒸水中，加鹽酸調(diào)節(jié)pH至6.8或8.8，定容至100mL。
6、4℃保存?？芍掳灰苯咏佑|皮膚。4.10%APS：(一周內(nèi)使用，最好新鮮配置)稱取0.5gAPS粉末，加入雙蒸水至5mL，充分溶解，4℃保存。5.10%SDS:秤取10gSDS粉末溶于100ml雙蒸水中，可50℃水浴下溶解，室溫保存。如在長期保存中出現(xiàn)沉淀，水浴溶化后，仍可使用5.分離膠（下層膠）：分離膠5%7.5%10%12%15%30%acrylamide/bis1.68ml2.5ml3.35ml4.02ml5ml1.5mol/LTris-HCl(pH8.8)2.5ml2.5ml2.5ml2.5ml2.5ml10%SDS100ul100ul100ul100
7、ul100ulDdH2O5.474.65ml3.8ml3.13ml2.15ml10%APS（灌膠時(shí)再加）50μL50μL50μL50μL50μLTEMED（灌膠時(shí)再加）5ul5ul5ul5ul5ul分離蛋白分子量57-212KD36-94KD20-80KD12-60KD10-43KD混勻后在室溫下靜置15min，然后加入5ulTEMED即為分離膠，即可灌膠。6.4%濃縮膠（上層膠）：0.7mL30%Acr/Bis；1.5mL0.5mol/LTris-HCl(pH6.8)；60μL10%SDS；3.6mL雙蒸水混勻后加入50μL10%APS和5μLTEMED（灌膠時(shí)
8、再加）。7
