westernblot詳細(xì)現(xiàn)用圖解

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1、實(shí)用文檔Western免疫印跡（WesternBlot）是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，然后利用抗體進(jìn)行檢測的方法。對已知表達(dá)蛋白，可用相應(yīng)抗體作為一抗進(jìn)行檢測，對新基因的表達(dá)產(chǎn)物，可通過融合部分的抗體檢測。大全實(shí)用文檔Western免疫印跡（WesternBlot）是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，然后利用抗體進(jìn)行檢測的方法。對已知表達(dá)蛋白，可用相應(yīng)抗體作為一抗進(jìn)行檢測，對新基因的表達(dá)產(chǎn)物，可通過融合部分的抗體檢測。大全實(shí)用文檔與Southern或Northern雜交方法類似，但WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋

2、白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。大全實(shí)用文檔經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達(dá)。?實(shí)驗(yàn)材料蛋白質(zhì)樣品試劑、試劑盒丙烯酰胺SDS?Tris-HClβ-巰基乙醇ddH2O甘氨酸Tris甲醇PBSNaC

3、lKClNa2HPO4KH2PO4ddH2O考馬斯亮蘭乙酸脫脂奶粉硫酸鎳胺H2O2DAB試劑盒儀器、耗材電泳儀電泳槽離心機(jī)離心管硝酸纖維素膜勻漿器剪刀移液槍刮棒大全實(shí)用文檔實(shí)驗(yàn)步驟一、試劑準(zhǔn)備?1.?SDS-PAGE試劑：見聚丙烯酰胺凝膠電泳實(shí)驗(yàn)。?2.?勻漿緩沖液：1.0MTris-HCl(pH6.8)1.0ml；10%SDS6.0ml；β-巰基乙醇0.2ml；ddH2O2.8ml。?3.?轉(zhuǎn)膜緩沖液：甘氨酸2.9g；Tris5.8g；SDS0.37g；甲醇200ml；加ddH2O定容至1000ml。?4.?0.01M

4、PBS(pH7.4)：NaCl8.0g；KCl0.2g；Na2HPO41.44g；KH2PO40.24g；加ddH2O至1000ml。?5.?膜染色液：考馬斯亮蘭0.2g；甲醇80ml；乙酸2ml；ddH2O118ml。包被液（5%脫脂奶粉，現(xiàn)配）：脫脂奶粉1.0g溶于20ml的0.01MPBS中。?6.?顯色液：DAB6.0mg；0.01MPBS10.0ml；硫酸鎳胺0.1ml；H2021.0μl。二、蛋白樣品制備大全實(shí)用文檔?1.?單層貼壁細(xì)胞總蛋白的提取?（1）倒掉培養(yǎng)液，并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液（或

5、將瓶直立放置一會兒使殘余培養(yǎng)液流到瓶底然后再用移液器將其吸走）。?（2）?每瓶細(xì)胞加3ml4℃預(yù)冷的PBS（0.01MpH7.2～7.3）。平放輕輕搖動1min洗滌細(xì)胞，然后棄去洗液。重復(fù)以上操作兩次，共洗細(xì)胞三次以洗去培養(yǎng)液。將PBS棄凈后把培養(yǎng)瓶置于冰上。?（3）按1ml裂解液加10μlPMSF（100mM），搖勻置于冰上。（PMSF要搖勻至無結(jié)晶時才可與裂解液混合。）?（4）?每瓶細(xì)胞加400μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，為使細(xì)胞充分裂解培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來回?fù)u動。?（5）裂解完后，用干凈的刮棒將細(xì)胞刮于

6、培養(yǎng)瓶的一側(cè)（動作要快），然后用槍將細(xì)胞碎片和裂解液移至1.5大全實(shí)用文檔ml離心管中。（整個操作盡量在冰上進(jìn)行。）?（6）于4℃下12000rpm離心5min。（提前開離心機(jī)預(yù)冷）?（7）?將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移倒0.5ml的離心管中放于－20℃保存。?2.?組織中總蛋白的提取?（1）將少量組織塊置于1～2ml勻漿器中球狀部位，用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎。?（2）?加400μL單去污劑裂解液裂（含PMSF）于勻漿器中，進(jìn)行勻漿。然后置于冰上。?（3）幾分鐘后再碾一會兒再置于冰上，要重復(fù)碾幾次使組織盡量碾碎。?大全實(shí)用

7、文檔（4）?裂解30min后，即可用移液器將裂解液移至1.5ml離心管中，然后在4℃下12000rpm離心5min，取上清分裝于0.5ml離心管中并置于－20℃保存。?3.?加藥物處理的貼壁細(xì)胞總蛋白的提取?由于受藥物的影響，一些細(xì)胞脫落下來，所以除按1操作外還應(yīng)收集培養(yǎng)液中的細(xì)胞。以下是培養(yǎng)液中細(xì)胞總蛋白的提取：?（1）將培養(yǎng)液倒至15ml離心管中，于2500rpm離心5min。?（2）棄上清，加入4mlPBS并用槍輕輕吹打洗滌，然后2500rpm離心5min。棄上清后用PBS重復(fù)洗滌一次。?（3）用槍洗干上清后，加1

8、00μL裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，裂解過程中要經(jīng)常彈一彈以使細(xì)胞充分裂解。?（4）將裂解液與培養(yǎng)瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm離心5min，取上清分裝于0.5ml離心管中并置于－20℃保存。大全實(shí)用文檔?三、蛋白含量的測定?1.?制作標(biāo)準(zhǔn)曲線?（1）從－20℃取出1mg/mlBSA，室溫融化后