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1、Western免疫印跡（WesternBlot）是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，然后利用抗體進(jìn)行檢測(cè)的方法。對(duì)已知表達(dá)蛋白，可用相應(yīng)抗體作為一抗進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)新基因的表達(dá)產(chǎn)物，可通過(guò)融合部分的抗體檢測(cè)。與Southern或Northern雜交方法類(lèi)似，但WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測(cè)物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過(guò)PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類(lèi)型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，
2、再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過(guò)底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測(cè)蛋白水平的表達(dá)。?實(shí)驗(yàn)材料蛋白質(zhì)樣品試劑、試劑盒丙烯酰胺SDS?Tris-HClβ-巰基乙醇ddH2O甘氨酸Tris甲醇PBSNaClKClNa2HPO4KH2PO4ddH2O考馬斯亮蘭乙酸脫脂奶粉硫酸鎳胺H2O2DAB試劑盒儀器、耗材電泳儀電泳槽離心機(jī)離心管硝酸纖維素膜勻漿器剪刀移液槍刮棒實(shí)驗(yàn)步驟一、試劑準(zhǔn)備?1.?SDS-PAGE試劑：見(jiàn)聚丙烯酰胺凝膠電泳實(shí)驗(yàn)。?2.?勻漿緩沖液：1.0MTris-HCl(pH6.8)1.
3、0ml；10%SDS6.0ml；β-巰基乙醇0.2ml；ddH2O2.8ml。?3.?轉(zhuǎn)膜緩沖液：甘氨酸2.9g；Tris5.8g；SDS0.37g；甲醇200ml；加ddH2O定容至1000ml。?4.?0.01MPBS(pH7.4)：NaCl8.0g；KCl0.2g；Na2HPO41.44g；KH2PO40.24g；加ddH2O至1000ml。?5.?膜染色液：考馬斯亮蘭0.2g；甲醇80ml；乙酸2ml；ddH2O118ml。包被液（5%脫脂奶粉，現(xiàn)配）：脫脂奶粉1.0g溶于20ml的0.01MPBS中。?6.?顯色液：DAB6.0mg；0.01
4、MPBS10.0ml；硫酸鎳胺0.1ml；H2021.0μl。二、蛋白樣品制備?1.?單層貼壁細(xì)胞總蛋白的提取?（1）倒掉培養(yǎng)液，并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液（或?qū)⑵恐绷⒎胖靡粫?huì)兒使殘余培養(yǎng)液流到瓶底然后再用移液器將其吸走）。?（2）?每瓶細(xì)胞加3ml4℃預(yù)冷的PBS（0.01MpH7.2～7.3）。平放輕輕搖動(dòng)1min洗滌細(xì)胞，然后棄去洗液。重復(fù)以上操作兩次，共洗細(xì)胞三次以洗去培養(yǎng)液。將PBS棄凈后把培養(yǎng)瓶置于冰上。?（3）按1ml裂解液加10μlPMSF（100mM），搖勻置于冰上。（PMSF要搖勻至無(wú)結(jié)晶時(shí)才可與裂解液混合。）?（4）?
5、每瓶細(xì)胞加400μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，為使細(xì)胞充分裂解培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來(lái)回?fù)u動(dòng)。?（5）裂解完后，用干凈的刮棒將細(xì)胞刮于培養(yǎng)瓶的一側(cè)（動(dòng)作要快），然后用槍將細(xì)胞碎片和裂解液移至1.5ml離心管中。（整個(gè)操作盡量在冰上進(jìn)行。）?（6）于4℃下12000rpm離心5min。（提前開(kāi)離心機(jī)預(yù)冷）?（7）?將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移倒0.5ml的離心管中放于－20℃保存。?2.?組織中總蛋白的提取?（1）將少量組織塊置于1～2ml勻漿器中球狀部位，用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎。?（2）?加400μL單去污劑裂解液裂（含PMSF）于勻漿器中，進(jìn)行
6、勻漿。然后置于冰上。?（3）幾分鐘后再碾一會(huì)兒再置于冰上，要重復(fù)碾幾次使組織盡量碾碎。?（4）?裂解30min后，即可用移液器將裂解液移至1.5ml離心管中，然后在4℃下12000rpm離心5min，取上清分裝于0.5ml離心管中并置于－20℃保存。?3.?加藥物處理的貼壁細(xì)胞總蛋白的提取?由于受藥物的影響，一些細(xì)胞脫落下來(lái)，所以除按1操作外還應(yīng)收集培養(yǎng)液中的細(xì)胞。以下是培養(yǎng)液中細(xì)胞總蛋白的提?。?（1）將培養(yǎng)液倒至15ml離心管中，于2500rpm離心5min。?（2）棄上清，加入4mlPBS并用槍輕輕吹打洗滌，然后2500rpm離心5min。棄上清
7、后用PBS重復(fù)洗滌一次。?（3）用槍洗干上清后，加100μL裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，裂解過(guò)程中要經(jīng)常彈一彈以使細(xì)胞充分裂解。?（4）將裂解液與培養(yǎng)瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm離心5min，取上清分裝于0.5ml離心管中并置于－20℃保存。?三、蛋白含量的測(cè)定?1.?制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)?（1）從－20℃取出1mg/mlBSA，室溫融化后，備用。?（2）取18個(gè)1.5ml離心管，3個(gè)一組，分別標(biāo)記為0mg，2.5mg，5.0mg，10.0mg，20.0mg，40.0mg。?（3）按下表在各管中加入各種試劑。（4）?混勻后，室溫放置2m
8、in。在生物分光光度計(jì)（Bio-Photometer，Eppendorf）上比色分析。?2.?
