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1、WesternBlot實(shí)驗(yàn)詳細(xì)介紹(―)主要試劑的配制1.細(xì)胞裂解液：根據(jù)目的蛋白所處的位置選擇恰當(dāng)?shù)牧呀庖海?1)胞漿蛋白很容易提取，裂解液屮可以不添加任何去污劑；(2)跨膜蛋0由于膜成分的干擾，就需要添加適當(dāng)?shù)娜ノ蹌邕x取NP-40裂解液或者RIPA緩沖液；(3)與細(xì)胞骨架結(jié)合的一些蛋白的提取則需耍添加如SDS等強(qiáng)去污劑。(4)核A蛋白的提取口」'以選擇RIPA緩沖液。注：Trizd提取的方法在實(shí)踐中也常常采用，但是會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的質(zhì)量有一定影響，所以此種方法慎用。2.30%(w/v)聚丙烯酰胺：取290g丙烯酰胺，10gBIS(T叉雙丙烯酰胺)，力U600
2、ml去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙猓尤ルx子水將溶液定容至1L,用0.45pn濾器濾去雜質(zhì)，于棕色瓶中4"C存放。消化道、呼吸道、皮膚粘膜等多種接觸途牦，可導(dǎo)致遺傳物質(zhì)損傷和基因突變，具有神經(jīng)毒性，可致癌。3.10%(w/v)SDS：取10g高純度的SDS，加80ml去離子水，68°C加熱溶解，緩慢加入濃鹽酸至PH7.2，加蒸餾水至100mL，室溫保存。SDS屬于強(qiáng)去污劑。4.1.5mMTris-HCL(pH8.8)：取181.7gTris-base,加800ml去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙饩徛尤霛恹}酸至PH8.8,讓溶液冷卻至室溫，加蒸餾水至1L，高溫高壓滅菌后，室溫保存
3、。5.0.5mMTris-HCL(pH6.8)：取60.6gTris-base,力U800ml去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙饩徛尤霛恹}酸至PH6.8,讓溶液冷卻至室溫，加蒸餾水至1L,高溫高壓滅菌/nf室溫保存。6.10%(w/v)AP(過硫酸銨)：提供W種丙稀酰胺聚☆所必須的自由基。取lg過硫酸銨，加10ml去離子水后充分溶解，4°C避光保存。注：最好臨用前配制，4"C保存1周。超過期限會(huì)失去催化作用。對(duì)皮膚粘膜有刺激性和腐蝕性。7.TEMED（四甲基乙二胺）：催化AP形成0由基而加速兩種丙稀酰胺的聚合。PH太低時(shí)，聚合反應(yīng)受到抑制。注：TEMED味道很難聞，每次取
4、200叫左右放入一個(gè)干凈的離心管中，4'C存放。極易揮發(fā)，用完一定要蓋緊蓋子！4.SDS-PAGE加樣緩沖液:pH6.8Tris緩沖液、甘油、SDS、巰基乙醇（高毒、殺蟲劑原料、笏爆品，新鮮配制?。?、溴酚藍(lán)浞勻備用。5.lOxTris-甘氨酸電泳緩沖液：3O.3gTris，188g甘氨酸，lOgSDS,用蒸餾水溶解至1000ml,得0.25mol/LTris-1.92mol/L甘氨酸電極緩沖液。臨用前稀釋10倍。6.lx轉(zhuǎn)移緩沖液：配制1L轉(zhuǎn)移緩沖液，需稱取2.9gU?氨酸、5.8gTris、0.37gSDS,并加入200ml甲醇，加水至總量1L。提前配制。注：
5、甲醛先不加，先將其他配好的溶液攪拌，在開始轉(zhuǎn)膜時(shí)，再講甲醛加進(jìn)去攪拌。7.NaN30.02%疊氮鈉（有毒，戴手套操作）：溶于磷酸緩沖鹽溶液（PBS）,可以防止抗體失活，但會(huì)稍影響結(jié)合效率，并使HRP失活。8.TBST（洗脫效果好）：配制1LTBST：量取100ml10xTBS+900ml超純水+lmlTween20o9.脫脂奶粉封閉液：lOOmlTBST中加入5g脫脂奶粉，攪拌均勻。（二）蛋白樣品制備1、單層貼壁細(xì)胞總蛋白的提?。旱沟襞囵B(yǎng)液預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞棄去洗液加裂解液（PMSF100mM/PI1:100）,吹勻置于冰上。4冰上裂解30min（不要超過lh
6、）,為使細(xì)胞充分裂解要經(jīng)常彈細(xì)胞。于4°C下12000rpm離心10min。一＞離心后的上清取lid測(cè)濃度，其余加loading煮樣后分裝放于-20°C保存（1周），-80°C（1月-1年）。注：細(xì)胞破碎多采用物理方法，如反復(fù)凍融法、冷熱交替法、超聲波法等。2、組織中總蛋白的提取：用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎，將少量組織塊置于1?2ml勻漿器屮球狀部位勻漿使組織破碎。然后按照每20毫克組織加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。（如果裂解不充分可以適當(dāng)添加更多的裂解液，如果需要高濃度的蛋白樣品，可以適當(dāng)減少裂解液的用量。）裂解30mhiG,即可用移液器將裂
7、解液移至1.5ml離心管中，然￡；在4°0卜*12000rpm離心5min,取上清分裝于0.5ml離心管中。注：組織的破碎多采用機(jī)械破碎法，如電動(dòng)搗碎機(jī)或勻漿機(jī)。使用勻漿機(jī)時(shí)要注意機(jī)器功率的選擇，太大也會(huì)破壞組織。特別注意的是：①實(shí)驗(yàn)期間將蛋白樣本保存于冰上；②每份樣本吸取均使用新的、一次性吸頭；③操作中配戴手套以防止其他蛋白以及蛋白酶的污染；④不要?jiǎng)×艺鹗幓蜻^度用力吸取，以減小蛋白變性可能性。（三）蛋白含量的測(cè)定蛋白定量的方法很多，如紫外光吸收法、雙縮脲法、Bradford、BCA、Lorry法等。其基木原理為用已知濃度的蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后測(cè)口的蛋白的光吸收
8、值,從曲線上查出對(duì)應(yīng)濃度
