westernblot實驗方案

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1、WesternBlotting匯報人：趙麗Westernblotting中文名稱為免疫印跡，其程序是對經處理的樣本（血清、培養(yǎng)細胞和組織勻漿）先進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE),以分離蛋白。然后將電泳后的分離開的蛋白轉移至具有結合力的膜上。對印跡膜進行封閉，以防止免疫試劑的非特異性吸附。最后對膜上的蛋白質進行檢測。Westernblotting實驗簡介方法優(yōu)點SDS-PAGE:高分辨力固相免疫測定：高特異性、敏感性1.方法簡便2.標本可長期保存3.結果便于比較WesternBlot基本原理在電場的作用下將電泳分離的多肽從凝膠轉

2、移至一種固相支持體，然后用這種多肽的特異抗體來檢測。WesternBlotting方法優(yōu)點：1.快速（一種抗體）2.沒有二抗交叉反應引起的非特異性條帶缺點：1.免疫反應性降低2.無信號二級放大3.抗體標記費時昂貴,使用不方便一:直接法WesternBlotting方法優(yōu)點：1.免疫特異性不受標記影響2.信號放大靈敏度高（多個二抗結合位點）3.多種標記的二抗可供選擇4.可選擇不同的Marker缺點：1.交叉反應引起的非特異性條帶2.額外的二抗孵育以及條件優(yōu)化二、間接法基本流程蛋白的提取倒掉培養(yǎng)液，并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液每瓶細胞加3

3、ml4℃預冷的PBS（0.01MpH7.2～7.3）。平放輕輕搖動1min洗滌細胞，然后棄去洗液。重復以上操作兩次，共洗細胞三次以洗去培養(yǎng)液。將PBS棄凈后把培養(yǎng)瓶置于冰上。按1ml裂解液加10?lPMSF（100mM），搖勻置于冰上。（PMSF要搖勻至無結晶時才可與裂解液混合。）每瓶細胞加400?l含PMSF的裂解液，于冰上裂解20min，為使細胞充分裂解培養(yǎng)瓶要經常來回搖動。裂解完后，用干凈的刮棒將細胞刮于培養(yǎng)瓶的一側（動作要快），然后用槍將細胞碎片和裂解液移至1.5ml離心管中。（整個操作盡量在冰上進行。）蛋白的提取每瓶細胞加400?l含

4、PMSF的裂解液，于冰上裂解20min，為使細胞充分裂解培養(yǎng)瓶要經常來回搖動。裂解完后，用干凈的刮棒將細胞刮于培養(yǎng)瓶的一側（動作要快），然后用槍將細胞碎片和裂解液移至1.5ml離心管中。（整個操作盡量在冰上進行于4℃下12000rpm離心5min。（提前開離心機預冷）將離心后的上清分裝轉移倒0.5min的離心管中放于－20℃保存。配10％分離膠加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。灌膠時，可用槍吸取，膠沿玻璃放出，待膠面升到綠帶中間線高度時即可。然后膠上加一層水，液封后的膠凝的更快。（灌膠時開始可快一些，膠面快到所需高度時要放慢速度。操作時膠一定要

5、沿玻璃板流下，這樣膠中才不會有氣泡。加水液封時要很慢，否則膠會被沖變型。）當水和膠之間有一條折射線時，說明膠已凝了。再等3min使膠充分凝固就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。配4％的濃縮膠加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。灌膠時也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產生。插梳子時要使梳子保持水平。由于膠凝固時體積會收縮減小，從而使加樣孔的上樣體積減小，所以在濃縮膠凝固的過程中要經常在兩邊補膠。待到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。將其放入電泳槽中。（小玻璃板面向內，大玻璃板面向外

6、。若只跑一塊膠，那槽另一邊要墊一塊塑料板)灌制分離膠隔絕空氣ddH2O0.1%SDS:<8%異丁醇：>8%灌制濃縮膠插入梳子加樣加足夠的電泳液后開始準備上樣。（電泳液至少要漫過內測的小玻璃板。）用微量進樣器貼壁吸取樣品將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品。（加樣太快可使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品溢出)StakinggelSeparatinggel電泳采用恒壓得方法：1.恒壓80V，至樣本跑過濃縮膠；2.將電壓調至120V至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，準備進行進行轉膜。轉膜轉膜現(xiàn)有兩種方法：A.半干轉：采用恒流的方法，按照1mA/cm2計

7、算總電流量，時間約為25-60min。（本法多使用NC膜）B.濕轉法：采用恒流的方法，橫流150mA，1-2小時。（本法多使用PVDF膜，本法會產生大量的熱量，且對溫度敏感度較高，需用大量冰塊降溫）轉一張膜需準備6張濾紙和1張轉印膜。切濾紙和膜時一定要戴手套，因為手上的蛋白會污染膜。轉膜前，轉印膜以及濾紙均需浸潤在電轉液中活化15-20min（其中PVDF膜需在無水甲醇中活化30min后再浸潤于電轉液中，且濾紙應與膠和膜的大小一致）。將玻板輕輕撬開，將凝膠剪裁后從玻板上移至電轉液中。從陰極到正極，按照三層濾紙凝膠轉印膜三層濾紙的順序制成“三明治

8、”（如為濕轉，應在三明治的兩側各加一層活化過的海綿，同時應注意去除膜、凝膠和濾紙之間的氣泡，且兩側的濾紙不能相搭，避免短路引起轉膜不全）。將制好的三明