豬圓環(huán)病毒2型lamp檢測方法建立和不同基因型感染性克隆的體外拯救

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1、Loop．mediatedisothermalamplificationfordetectionofporcinecircovirustype2andidentificationofrescuedvirusesfrominfectiousclonesoftwogenogroupsinvitroThesissubmittedt013eslsSUbmltteQngdaoAgriculturalUniversityInFulfillmentoftheRequirementfortheDegreeof—M

2、asterofAgronomHanSi(CollegeofAnimalScienceandTechnology)Supervisor：WangJinbaoQingdao．ChinaJune，2012獨(dú)創(chuàng)性聲明IUllFllllllElllllllllllllfillIMIIllllIY2333085本人聲明所呈交的論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得青島農(nóng)業(yè)大學(xué)或其它教育機(jī)

3、構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意。研究生簽名：椒時(shí)間：勵(lì)年參月妒關(guān)于論文使用授權(quán)的說明本人完全了解青島農(nóng)業(yè)大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：學(xué)校有權(quán)保留送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。同意青島農(nóng)業(yè)大學(xué)可以用不同方式在不同媒體上發(fā)表、傳播學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容。(保密的學(xué)位論文在解密后應(yīng)遵守此協(xié)議)研究生躲韓彳紅慨沁肝鄉(xiāng)月必日導(dǎo)師簽名：互垂寥時(shí)間：年月

4、日豬圓環(huán)病毒2型LAMP檢測方法建立和不同基因型感染性克隆的體外拯救摘要豬圓環(huán)病毒(Porcinecircovirus)是無囊膜單股負(fù)鏈環(huán)狀DNA病毒，于1974年首次從豬腎傳代細(xì)胞(PKl5)中分離得到，根據(jù)致病性、抗原性和核酸序列的差異，分為PCVl和PCV2兩型。PCVl無致病性，PCV2是危害世界養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展，引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)、豬皮炎與腎病綜合征(PDNS)、仔豬先天性震顫(CT)、母豬繁殖障礙等多種疾病的重要病原之一。PCV2感染豬體后，侵害其免疫系統(tǒng)，使機(jī)體抵抗力

5、下降而引起繼發(fā)感染和混合感染，造成更嚴(yán)重的損失。本研究利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)建立了一種新的檢測PCV2核酸的方法，擴(kuò)充了實(shí)驗(yàn)室檢測抗原的方式，由于LAMP檢測方法擺脫了昂貴儀器的束縛，適合于條件受到限制的基層臨床診斷。此外，本研究根據(jù)PCV2型特異性基序Cap蛋白86．91位氨基酸序列，在對實(shí)驗(yàn)室保存的菌株進(jìn)行篩選，得到連有PCV2a和PCV2b兩型毒株的質(zhì)粒，酶切之后環(huán)化PCV全長，轉(zhuǎn)染PKl5細(xì)胞，并成功拯救出兩型病毒。得到可用的感染性克隆后，便可以改造基因序列從而改變決定分型的6

6、個(gè)氨基酸殘基，為以后開展的型特異性序列與病毒致病力的關(guān)系研究打下了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。以PCV2ORF2序列作為靶基因，用PrimerExplorerV4設(shè)計(jì)出4條LAMP引物。通過對體系各組分的優(yōu)化建立最佳體系，確定63℃為最適反應(yīng)溫度，1h以內(nèi)就能完成對核酸的擴(kuò)增。制備出梯度質(zhì)粒模板，與PCR方法在靈敏度試驗(yàn)中進(jìn)行比較。LAMP方法最小檢出量達(dá)到接近1拷貝，敏感性是之前實(shí)驗(yàn)室所用PCR方法的一萬倍。并且，相同條件下，與PCVl、PRV或PPV的DNA均無交叉反應(yīng)現(xiàn)象。在臨床病料檢測中同樣有著良好的表現(xiàn)。

7、在結(jié)果判定方面，LAMP不光可借助瓊脂糖凝膠電泳呈現(xiàn)出特有的階梯狀條帶，也可以向擴(kuò)增產(chǎn)物中添加SYBRGreenI核酸染料，通過肉眼觀察顏色變化。綜上，LAMP在對PCV2抗原檢測中，不論是檢測時(shí)間、條件要求、靈敏度都要優(yōu)于PCR方法。對實(shí)驗(yàn)室保存的、之前測序過的、連有PCV2DNA全長的重組質(zhì)粒的菌種進(jìn)行篩選，PCV2Cap蛋白86．9l位氨基酸序列若為TNKISl分屬PCV2a型，若為SNPRSV則為PCV2b型。搖菌再送測序，確定選擇D1株(HMl42897)為PCV2a代表，SDl株(DQ

8、346683)為PCV2b代表。PCV2基因序列中有唯一的SacII酶切位點(diǎn)，當(dāng)時(shí)擴(kuò)增PCV2全長的上下游引物便設(shè)立在此。因此以SacII酶切重組質(zhì)粒pMDl8．T-D1和pMDl8．T-SDl，先得到PCV2a和PCV2b的線性DNA全長，切膠回收后將其環(huán)化，使用環(huán)化DNA轉(zhuǎn)染PKl5細(xì)胞，收毒作為PO代。在P4、P9代兩型病毒液的IFA檢測中，分別都可見熒光，且明顯P9代要比P4代明亮。對幾代病毒液的PCR檢測，也可見隨著代數(shù)增加，條帶亮度逐漸變亮。以上都證明了病毒復(fù)制的存在。