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《四川省豬嵴病毒病流行病學(xué)調(diào)查及間接elisa抗體檢測(cè)方法的建立》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、萬方數(shù)據(jù)論文獨(dú)創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所呈交的學(xué)位論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行研究工作所取得的成果。盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，學(xué)位論文中不包含其他個(gè)人或集體己經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得四JII農(nóng)業(yè)大學(xué)或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書所使用過的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意。研究生簽名：礫蕾陽l牛if-6月f舊關(guān)于論文使用授權(quán)的聲明本人完全了解四川農(nóng)業(yè)大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：學(xué)校有權(quán)保留并向國(guó)家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和
2、電子版，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。同意四川農(nóng)業(yè)大學(xué)可以用不同方式在不同媒體上發(fā)表、傳播學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容。。本論文不保密。。本論文保密，在一年解密后適用本授權(quán)。(請(qǐng)?jiān)谝陨?。?nèi)劃“4”)研究生簽名：導(dǎo)師簽名‘礫蕾妙鄉(xiāng)宇文如l牛年6月ff日7，‘中年6月I／日萬方數(shù)據(jù)中文摘要豬嵴病毒(Porcinekobuvirus)是微小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)嵴病毒屬(Kobuvirus)成員。2008年，匈牙利學(xué)者首次報(bào)道在無臨床癥狀表現(xiàn)的豬糞便中發(fā)現(xiàn)豬
3、嵴病毒；2009年，在中國(guó)豬群中也檢出了豬嵴病毒。自此之后，多個(gè)國(guó)家報(bào)道在豬群中檢測(cè)到豬嵴病毒，包括泰國(guó)、臼本、韓國(guó)、荷蘭、巴西、西班牙、意大利、東非等。豬嵴病毒是一種具有傳染性、在世界范圍內(nèi)廣泛分布的新型病毒，在腹瀉豬中有較高檢出率，認(rèn)為可能是豬腹瀉的病原，但鑒于其在沒有腹瀉的豬群中也普遍存在，且目前尚未能實(shí)現(xiàn)體外分離培養(yǎng)，需要更多的研究來闡明其生物學(xué)特性及病原特性。本研究旨在對(duì)四川地區(qū)豬嵴病毒病流行情況進(jìn)行調(diào)查，并對(duì)四川株豬嵴病毒VPI基因分子流行病學(xué)特點(diǎn)進(jìn)行分析；VP]蛋白是嵴病毒暴露在最外面的結(jié)構(gòu)蛋白，是嵴病
4、毒的優(yōu)勢(shì)免疫蛋白，本研究通過大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)豬嵴病毒VPl蛋白優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)，利用純化的重組蛋白建立一種檢測(cè)豬血清中豬嵴病毒抗體的間接ELISA方法，為今后豬嵴病毒血清學(xué)診斷方法的研究奠定基礎(chǔ)。本研究在2011．2012年從四川豬場(chǎng)中收集了163份豬糞便和腸道組織樣品，其中112份來自腹瀉豬，51份來自沒有腹瀉的豬。利用RT-PCR方法對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，豬嵴病毒的總陽性率為53．4％(87／163)，腹瀉樣品中豬嵴病毒總檢出率為64．3％(72／112)，采集自無腹瀉豬的樣品中，豬嵴病毒的感染率為29．4％(15
5、／51)。利用SPSS21．0軟件對(duì)腹瀉組數(shù)據(jù)和無腹瀉組數(shù)據(jù)進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，結(jié)果顯示豬嵴病毒感染和腹瀉具有極顯著相關(guān)性，2=17．126，P=3．5×10一；在哺乳仔豬、保育豬、育肥豬和成年母豬中，豬嵴病毒的感染率依次為：66．7％、39．1％、23．5％、40．0％，對(duì)四個(gè)年齡段感染數(shù)據(jù)進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，分析顯示哺乳仔豬和豬嵴病毒感染具有極顯著相關(guān)性，，=10．941，P=9．4x10卅。腹瀉豬和幼齡豬可能對(duì)豬嵴病毒更易感。利用RT-PCR擴(kuò)增豬嵴病毒VPl基因序列，通過分子克隆，測(cè)序得到35個(gè)豬嵴病毒VPl基因序列(G
6、enBank登錄號(hào)：KFl57917-KFl57951)，核苷酸序列相似性為80．7％一100％，氮基酸序列相似性為87．2％．100％。利用MEGA5．0軟件對(duì)豬嵴病毒VPl基因序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果顯示本研究獲得的四川株豬嵴病毒分屬于四個(gè)大的分支，說明多株豬嵴病毒在四川地區(qū)流行，進(jìn)化樹顯示豬嵴病毒VPl基因序列的分群無明顯地域性差異。通過序列分析，表明在兩只豬的糞便樣品中分別檢出3株和2株豬嵴病毒共同感染，首次為多株豬嵴病毒共感染提供了依據(jù)；通過重組分析軟件㈣蕁j『刪7～㈣紲腳1～㈣姐萬方數(shù)據(jù)RDP和Simp
7、lot預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)3株共感染的豬嵴病毒A1、A2、A3之間存在重組事件，A2序列的VPl區(qū)段可能是由于A1和A3之間發(fā)生重組產(chǎn)生的。重組事件的發(fā)生會(huì)推動(dòng)病毒基因組的進(jìn)化，導(dǎo)致基因多樣性的發(fā)生。本研究通過BepiPred、Bcepred、DNAStar中Protean來預(yù)測(cè)分析豬嵴病毒VPl蛋白線性抗原表位，綜合各種預(yù)測(cè)結(jié)果，選擇抗原表位較集中、抗原指數(shù)較高的前半段(1—462bp)作為豬嵴病毒優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)，將選取的基因片段送公司進(jìn)行密碼子優(yōu)化后合成基因，將合成的基因片段定向克隆至原核表達(dá)載體pET32a(+)00，構(gòu)
8、建重組表達(dá)質(zhì)粒pET32一VPl，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，通過對(duì)誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化，確定37。C，0．2mmol／LIPTG誘導(dǎo)表達(dá)4h為最佳誘導(dǎo)條件，重組蛋白大小為35．6KDa，以可溶性形式存在，在Westernblot檢測(cè)中，通過Ni柱純化的VPl重組蛋白和豬嵴病毒陽性血清存在特異性反應(yīng)，說明重組蛋白具有良
