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1、AGRICULTURALUNIVERSITYOFHEBEI碩士學(xué)位(畢業(yè))論文豬博卡病毒間接ELISA診斷方法的建立學(xué)位申請人:鄭英帥指導(dǎo)教師：孫繼國教授袁萬哲副教授學(xué)科專業(yè)滪防獸醫(yī)學(xué)學(xué)位類別：農(nóng)學(xué)碩士授予單位：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)答辯日期：二〇一五年五月二十四日獨創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進行的研宄工作及取得的研宄成果。據(jù)我所知’除了文中特別加以標注和致謝的地方外，論文中不包含其他人己經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研宄成果，也不句,含為獲得河北農(nóng)業(yè)大學(xué)或其他教育機構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本
2、研宄所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。學(xué)位論文作者簽名:7簽字日期：并#年今月：學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書太登位論IT作者完含了解河北農(nóng)業(yè)大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定’有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤’允許論文被查閱和借閱。太人桴權(quán)河北農(nóng)業(yè)大學(xué)可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。(保密的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)書）學(xué)位論文作者簽名:導(dǎo)師簽名:簽字日期年》月葉日簽字日期年巧月f曰學(xué)位論文作者畢業(yè)后去向:工作單位
3、：電話:由扁通訊地址:分類號:S851.34單位代碼:10086密級:公開學(xué)號:2012362豬博卡病毒間接ELISA診斷方法的建立TheEstablishmentofIndirectELISAforDiagnosisofPorcinebocavirus學(xué)位申請人：鄭英帥指導(dǎo)教師：孫繼國教授袁萬哲副教授學(xué)科專業(yè)：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)學(xué)位類別：農(nóng)學(xué)碩士授予單位：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)答辯日期：二〇一五年五月二十四日摘要豬博卡病毒(PBoV)最早于2009年在瑞典被發(fā)現(xiàn)，迄今為止，對于其傳播方式，侵染機制，及其基因組功能都不甚明了，但是世界各
4、國學(xué)者在進行該病毒的流行病學(xué)調(diào)查時發(fā)現(xiàn)，該病毒在PMWS患豬中陽性率較高。另外還有學(xué)者提出豬博卡病毒可能與呼吸道疾病病原共感染機體。目前大多認為其基因組編碼3個開放閱讀框(ORF)分別對應(yīng)非結(jié)構(gòu)蛋白NS1、抗原蛋白VP、和非結(jié)構(gòu)蛋白NP1，VP蛋白為豬博卡病毒主要的抗原蛋白，但變異性較高，非結(jié)構(gòu)蛋白NP1，編碼一個相對保守且高度磷酸化的非結(jié)構(gòu)性蛋白質(zhì)。目前世界各國對該病毒的檢測也僅僅局限于一些不成熟的PCR檢測方法，并無血清學(xué)檢測方法的問世，因而有效的血清學(xué)診斷方法的研究迫在眉睫，本研究成功的在河北地區(qū)病豬體內(nèi)提取出豬
5、博卡病毒基因，分別對NP1基因和VP2基因進行B細胞線性抗原表位的預(yù)測分析，并對保守的NP1基因和截短的相對保守的VP2基因進行克隆表達，分別將純化的NP1蛋白和VP2截短蛋白作為包被抗原，經(jīng)過優(yōu)化條件和相對比較建立了快速檢測豬博卡病毒病的血清學(xué)診斷方法。根據(jù)NCBI系統(tǒng)中GenBank已發(fā)表的豬博卡病毒NP1和VP2基因序列，設(shè)計合成特異性引物，采用降落PCR技術(shù)擴增NP1基因和截短的VP2基因序列，克隆后進行測序，測序正確后進行克隆載體與加酶切位點的目的片段的連接轉(zhuǎn)化，并分別將質(zhì)粒命名為PMD-NP1和PMD-VP
6、2。對重組質(zhì)粒PMD-NP1和PMD-VP2進行雙酶切得到帶酶切位點的NP1基因和截短的VP2基因并將其與原核表達載體pET32a連接，構(gòu)建表達質(zhì)粒pET32a-NP1和pET32a-VP2。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后SDS-PAGE電泳可分別檢測到分子質(zhì)量約為44ku和35ku的蛋白，與預(yù)期的蛋白分子量大小基本一致，以可溶性形式存在于上清中，同時在包涵體中也大量存在。利用原核表達載體pET32a上帶有的His標簽對pET32a-NP1和pET32a-VP2重組蛋白進行純化，純化蛋白經(jīng)Western-blotting結(jié)果顯示，重
7、組蛋白與PBOV陽性血清具有良好的反應(yīng)原性。表明分子質(zhì)量約43ku和37ku的蛋白即為目的蛋白。以純化的兩種重組蛋白分別作為包被抗原，通過對各自反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了檢測PBoV抗體的間接ELISA檢測方法，并比較兩種ELISA檢測方法。優(yōu)化結(jié)果顯示，以NP1蛋白為包被抗原的抗原最佳包被濃度為4μg/mL；封閉液為2%的明膠工作液；陰陽性血清最佳稀釋度為1∶80，二抗的最佳稀釋度為1∶1000，底物顯色時間為10min。該方法與CSFV、PRRSV、PPV、PCV2陽性血清不發(fā)生交叉反應(yīng)，批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗的變異系數(shù)
8、(CV)均值都小于10%，而以VP2蛋白為包被抗原的抗原最佳包被濃度為2μg/mL；封閉液為2%的明膠工作液；陰陽性血清最佳稀釋度為1∶80，酶標抗體最佳稀釋度為1∶1000，底物顯色時間為15min。該方法與CSFV、PRRSV、PPV、PCV2陽性血清不發(fā)生交叉反應(yīng)，批內(nèi)重復(fù)性試驗和批間重復(fù)性試驗的變異系數(shù)(CV)均小于10%
