c-maf泛素化及其泛素連接酶的研究

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1、蘇州大學學位論文獨創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所提交的學位論文是本人在導師的指導下，獨立進行研究工作所取得的成果。除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本論文不含其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不含為獲得蘇州大學或其它教育機構的學位證書而使用過的材料。對本文的研究作出重要貢獻的個人和集體，均已在文中以明確方式標明。本人承擔本聲明的法律責任。論文作者簽名：壁j蛩搬日1愀蘇州大學學位論文使用授權聲明一一本人完全了解蘇州大學關于收集、保存和使用學位論文的規(guī)定，即：學位論文著作權歸屬蘇州大學。本學位論文電子文檔的內(nèi)容和紙質(zhì)論文的內(nèi)容相一致。蘇州大學有權向

2、國家圖書館、中國社科院文獻信息情報中心、中國科學技術信息研究所(含萬方數(shù)據(jù)電子出版社)、中國學術期刊(光盤版)電子雜志社送交本學位論文的復印件和電子文檔，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或其他復制手段保存和匯編學位論文，可以將學位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關數(shù)據(jù)庫進行檢索。涉密論文口本學位論文屬在——年一月解密后適用本規(guī)定。非涉密論文囪論文作者簽名：畿魚盜日導師簽名：雄日期：知l；-q-幻期：翌豎：星：絲c．Maf的泛素化及其泛紊連接酶的研究中文摘要第一部分篩選c—Maf關鍵泛素化位點目的：利用定點突變技術構建c—Maf的賴氨酸位點突

3、變體，結合各突變體對蛋白酶體抑制劑硼替佐咪的不同反應，篩選關鍵突變位點，確定各賴氨酸位點對c—Maf泛素化的影響。方法：1．通過定點突變PCR技術將c—Maf蛋白質(zhì)的賴氨酸突變?yōu)榫彼?K--)R)，得到c—Maf單一賴氨酸突變位點(例如K29R)和M14(全突變體)以及多突變體；同時構建c．Maf含單一賴氨酸的突變體(例如K29)，然后將各突變體分別轉染到HEK293T細胞中，36hrs后加入蛋白酶體抑制劑硼替佐咪(BZ)，進一步處理12hrs，然后用Westernblotting方法檢測各突變體對c—Mar穩(wěn)定性的影響，并進‘步篩選出可以

4、介導c．Maf泛素化的關鍵賴氨酸位點。2．將篩選的關鍵突變體及野生型和全突變體轉染到HEK293T細胞中，6hrs后加入蛋白酶體抑制劑MGl32處理4hrs，用免疫沉淀法檢測各突變體對c—Maf泛素化水平的影響。3．將關鍵突變體及野生型和全突變體構建到pEGFP—C3中，36hrs后乙醇固定并用DAPI染核，用激光共聚焦檢測c—Maf的胞內(nèi)分布。4．將關鍵突變體及野生型和全突變體同CCND2一Luc共轉染到HEK293T細胞中，36hrs后檢測其對熒光素酶活性的影響。結果：1．c．Maf單點突變無法抑制c．Maf的泛素化降解，同時單一賴氨酸的

5、存在也不能單獨介導c．Maf的泛素化降解。多個賴氨酸的存在，例如同時保留第85位和350位賴氨酸位點K(85，350)可以介導c—Maf的泛素化降解。2．IP結果顯示K(85，350)的c—Maf突變體有明顯的多聚泛素化條帶，但這兩個位點同時突變的多位點突變體也存在多聚泛素化條帶，證明這兩個位點參與c．Maf中文摘要c-Maf的泛素化及其泛素連接酶的研究泛素化，但也不是唯一的。3．共聚焦結果顯示K(85，350)(同時保留85位與350位賴氨酸)、K(85，350)R(同時突變85位與350位賴氨酸)突變體同野生型c—Maf一樣主要分布在核內(nèi)

6、，而完全突變體在核內(nèi)和胞質(zhì)中均有分布，提示c—Maf部分賴氨酸位點突變不影響其胞內(nèi)定位，而完全突變可能由于泛素化修飾的改變導致其細胞內(nèi)分布的變化。4．熒光素酶活性結果顯示，K(85，350)、K(85，350)R多位點突變體以及全突變體相比野生型c．Maf能明顯增強CCND2啟動子的轉錄活性，這可能與c—Maf蛋白的降解受到抑制有關。c—Maf的泛素化是由多個賴氨酸位點介導的，例如c．Maf蛋白中K85和K350對于其泛素化很重要，但它們并不是唯一的。K(85，350)和K(85，350)R多突變體不影響蛋白在細胞中的定位，但由于其降解受到一

7、定程度的抑制，可明顯增強其對CCND2的轉錄活性。第二部分c．Maf的溶酶體降解途徑目的：全突變c．Maf(M14)突變體的泛素化降解被抑制，但在實驗中仍發(fā)現(xiàn)其發(fā)生降解，由于蛋白質(zhì)主要存蛋白酶體和溶酶體兩種降解途徑，我們推測c．Maf可能也通過溶酶體降解。本部分將利用不同的溶酶體抑制劑和蛋白酶體抑制劑抑制蛋白質(zhì)降解，以證明c．Maf在泛素化降解的同時也存在著溶酶體降解。方法：1．轉染wT與M14c—Maf質(zhì)粒到HEK293T細胞中，用放線菌酮(CHX。100ng／mL)處理細胞不同時間(0、4、8、12hrs)后，收取細胞進行WestemBl

8、otting分析，檢測蛋白的變化情況。2．轉染W(wǎng)T與M14c．Maf質(zhì)粒到HEK293T細胞中，加入放線菌酮(CHX100ng／mL)抑制蛋白合成，同時加入蛋白酶體