耐輻射異常球菌過氧化物酶osmc與ohr的功能研究

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1、CIassifjedIndex：U．D．C：SouthwestUniversityofScienceandTechnoIogyMasterDegreeThesiSF‘‘onaIanaIYiofperox—OsmCandOhrunctionaIanaYSSotroxIdaseOsmCandr‘int．DeinococcusradioduransR1Grade：2011．Candidate：GuangyanCuiAcademicDegreeAppIiedfor：MasterSpeciaIity：BotanySupercisor：Prof．JinWangMarch30，

2、20140UllU11111UlIUlY2586139獨創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的論文是我個人在導(dǎo)師指導(dǎo)下獨立進行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得西南科技大學(xué)或其它教育機構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意。簽名：柑也日期：J-‘i'f．‘．s關(guān)于論文使用和授權(quán)的說明本人完全了解西南科技大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：學(xué)校有權(quán)保留學(xué)位論文的復(fù)印件，允許該論文被查閱和借閱；學(xué)?？梢怨荚撜撐?/p>

3、的全部或部分內(nèi)容，可以采用影印、縮印或其他復(fù)制手段保存論文。(保密的學(xué)位論文在解密后應(yīng)遵守此規(guī)定)簽名：桎胞導(dǎo)師簽名：元乃彩日期桫∥．多。j／西南科技大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文第1頁摘要過氧化物酶(Peroxiredoxin，簡寫為Prx)是一種普遍存在于生物體中用于清除過氧化物的物質(zhì)。細菌等微生物中的Prx可以分成兩類：含兩個半胱氨酸的過氧化物酶(2-CysPrx)和只含一個半胱氨酸的過氧化物酶(1-CysPrx)。耐輻射異常球菌是一種具有超強電離輻射抗性的微生物，且對氧化、干旱和高鹽脅迫也具有極強的耐受力。異常球菌基因組中的DR1538和DR1857兩個基因分別編

4、碼了OsmC和Ohr蛋白，這兩個蛋白均屬于2-CysPrx。我們主要通過構(gòu)建基因缺失突變株、脅迫表型鑒定、轉(zhuǎn)錄水平表達分析、蛋白純化和體外酶活測定等方法來研究OsmC和Ohr蛋白的功能。實驗結(jié)果如下：通過對osmC和ohr兩個基因進行生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明：osmC基因全長441bp，編碼146個氨基酸殘基(aa)，蛋白質(zhì)的分子量大小約為15．7kDa；ohr基因長420bp，編碼139aa，蛋白質(zhì)的分子量為14．5kDa；氨基酸結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果表明OsmC和Olaf同屬于OsmC超家族；多序列氨基酸的同源比對結(jié)果表明，OsmC與Ohr亞家族蛋白之間只有約20％的

5、同源性，兩個亞家族各自的同源性為40％．60％，；OsmC和Ohr蛋白的二級結(jié)構(gòu)都主要是由旺．螺旋及不規(guī)則卷曲組成的，兩個蛋白都為親水性蛋白；并運用同源建模方法對未知結(jié)構(gòu)蛋白OsmC進行了三維結(jié)構(gòu)預(yù)測?！ねㄟ^體外三段融合PCR技術(shù)和線性轉(zhuǎn)化方法構(gòu)建了耐輻射異常球菌AosmC與Aohr突變株。從野生型菌株、AosmC與Aohr突變株在正常條件下的生長情況可以看出三株菌的生長差異并不顯著，表明osmC基因與ohr基因并不影響耐輻射異常球菌菌株的生長；野生型菌株、AosmC和Aohl·突變株在幾種不同脅迫沖擊(H202、CHP、山梨醇、NaCl和乙醇)下的表型鑒定結(jié)果表

6、明AosmC突變株對H202脅迫沖擊極端的敏感，對過氧化異丙苯(CHP)沖擊并不敏感，而Aohr突變株對CHP的沖擊敏感，對H202的沖擊并不敏感，而三個菌株在其他脅迫(山梨醇、NaCl、乙醇)沖擊下的表型差異并不明顯。在上述幾種脅迫沖擊條件下，野生型菌株中的osmC基因與ohr基因的的相對表達量測定結(jié)果表明，osmC基因受到了H202的顯著誘導(dǎo)，與未處理菌株相比，表達量上升了約8．9倍，而osmC基因在其他脅迫下的相對表達量上升不明顯：ohr基因在幾種脅迫(H202、CHP、NaCl)沖擊下的相對表達量都上升了約2倍。西南科技大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文第

7、I頁通過構(gòu)

8、建pET28a-osmC、pTWINl．ohr重組表達菌株，我們獲得了純化的OsmC蛋白與Ohr蛋白，并對兩者在體外的底物降解速率進行了測定，結(jié)果表明OsmC和Ohr蛋白都能降解H202與CHP，其中OsmC蛋白降解H202的速率要大于降解CHP的速率，與之相反的是，Ohr蛋白降解CI-IP的速率要大于降解H202的速率。以上實驗結(jié)果表明OsmC蛋白與Ohr蛋白在體外選擇底物的偏好性并不一致，OsmC偏好選擇H202，Ohr偏好有機過氧化物。而它們在體內(nèi)的底物選擇和具體活性位點還需要進一步研究。關(guān)鍵詞：耐輻射異常球菌；過氧化物氧化還原酶；OsmC與Ohr；非生物脅

9、迫；酶活測