中國林蛙抗菌肽分離鑒定、cdna克隆及其原核表達(dá)載體構(gòu)建

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1、中國林蛙抗菌肽分離鑒定、cDNA克隆及其原核表達(dá)載體的構(gòu)建中文摘要背景與目的；抗菌肽(antibacterialpeptides)又叫抗微生物肽(antimicrobialpeptides)，肽抗生素(peptideantibiotics)，是由10-50個氨基酸殘基組成，常帶正電荷，并具有廣譜抗菌活性的小肽，是生物先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分。兩棲動物皮膚裸露、潮濕，這無疑給微生物提供了一個極好的生存環(huán)境。但在長期的自然選擇過程中，它們逐漸形成了防御機制，即由背部及腹部皮膚的分泌抗菌類物質(zhì)來抵御有害環(huán)境因子的侵襲。蛙類皮膚生物活性肽是抗菌肽家族的重要成員，其不但種類繁多，而且數(shù)

2、量龐大。通過結(jié)構(gòu)與同源性分析表明這些抗菌肽屬于Magainin、Bombinin、Bombinin-like、Brevinin，Esculentin、Rmmmerin、Temporin、Ranalexin、Aurein、Caerin和Citropin等抗菌肽家族。兩棲類抗菌肽具有高效、廣譜的抗菌作用，且不易產(chǎn)生耐藥性等特點，其這些特性激起了人們極大的興趣，在耐抗生素病原菌株不斷出現(xiàn)的今天，抗菌肽有望成為新一代的臨床抗菌藥物。本研究已成功克隆中國林蛙抗菌肽基因全長cDNA序列，在GenBanK中進(jìn)行登錄(登錄號：DQ673105)，并采用生物信息學(xué)的方法對核酸序列以及氨基酸序列進(jìn)

3、行分析，進(jìn)而對蛋白的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行預(yù)測、分析，為中國林蛙抗菌肽分子生物學(xué)水平研究奠定了基礎(chǔ)。同時，將編碼成熟抗菌肽基因序列亞克隆至原核表達(dá)載體PGEX-3X中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。方法：(1)利用反相高效液相色譜(reversephasehighperformanceliquidchromatographyRP—HPLC)和質(zhì)譜(massspectromeU7)檢測技術(shù)對中國林蛙皮膚分泌物中抗菌肽進(jìn)行分離純化和分析，并以革蘭氏陰性菌大腸埃希氏桿菌(G．E．coli)和革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌(G+S．a(chǎn)ureus)為測試菌株，通過瓊脂擴散法對分離出的多肽進(jìn)行

4、抑菌活性測定。應(yīng)用Edman降解法對有抑菌活性的多肽物質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。(2)以N末端氨基酸測序結(jié)果(Mm依KsMLL)為遞交序列，結(jié)合NcBI中blasm比對結(jié)果設(shè)計蛙屬抗菌肽簡并引物。(3)采用異硫氰酸胍法在無№的環(huán)境條件下制備中國林蛙皮膚組織總RNA．(4)以提取的中國林蛙皮膚總RNA。為模板，采用3’RACE(RapidAmplificationOfcDNAEnds)技術(shù)進(jìn)行中國林蛙抗菌肽基因的cDNA克隆，測序分析。同時，運用生物信息學(xué)軟件對其全長eDNA序列進(jìn)行閱讀框架、同源性比較和相關(guān)的生物學(xué)功能分析。(5)根據(jù)eDNA克隆所獲得的中國林蛙抗菌肽基因中編碼成熟肽的序

5、列設(shè)計合成引物，以全長eDNA序列為模板，通過PCR擴增，獲得帶有限制性酶切位點的目的片段。(6)采用T／A克隆法將目的序列插,入pNIDl8-Tsimple克隆載體，測序，正確后將酶切的目的序列亞克隆至經(jīng)相應(yīng)限制性內(nèi)切酶消化處理的原核表達(dá)載體pGEX-3X上，構(gòu)建原核重組表達(dá)載體。將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中，用彤I．G進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，采用SDS-PAGE電泳進(jìn)行分析檢測。結(jié)果：(1)應(yīng)用RACE技術(shù)成功的獲得了一條中國林蛙抗菌肽基因的全長cDNA序列。序列全長為297bp，其中包括213bp完整的開放閱讀框(openreadingframeORF)，含有8

6、4bp的3’非轉(zhuǎn)譯區(qū)(3’UTR)，推測編碼71個氨基酸的多肽，分子量(MW)為7810．9Da，等電點(pI)為5．08。經(jīng)生物信息學(xué)分析表明，中國林蛙CAMPs-3氨基酸序列N末端均含有一個相對保守的由22個氨基酸組成的信號肽(signlepeptide)序列，還包含有一個拷貝由個33氨基酸組成的成熟肽(maturepeptide)，在信號肽和成熟體之間，是一段富含酸性氨基酸的酸性間隔序列(acidicspacerdomain)。經(jīng)同源性分析，在氨基酸水平的同源性高于核苷酸水平的同源性，該序列已被GcnBanK收錄，登錄號為DQ673105．(2)將編碼成熟肽的目的序列亞克

7、隆至pMDIS-Tsimple克隆載體中，經(jīng)測序顯示其編碼氨基酸序列與原始序列完全一致。將酶切后的目的序列插入PGEX-3X原核表達(dá)載體中構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-chensirin-3，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后。表達(dá)出相對分子質(zhì)量為30kDa的GST融合蛋白．結(jié)論：(1)從中國林蛙皮膚組織中分離出一條新的編碼抗茵肽前體CAMPs·3的全長cDNA序列，經(jīng)NCBI網(wǎng)站中的blastp服務(wù)器分析發(fā)現(xiàn)與ranamefin和brevinin家族抗菌肽具有較高的同源性，分別為90％-72％，70％-53％。