資源描述：
《少孢節(jié)叢孢菌侵染性胞外絲氨酸蛋白酶的基因克隆、表達(dá)及其殺線蟲(chóng)活性研究》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。
1、分類號(hào)：密級(jí)：學(xué)號(hào)：2010108055單位代碼：10759石河子大學(xué)碩士學(xué)位論文少孢節(jié)叢孢菌侵染性胞外絲氨酸蛋白酶的基因克隆、表達(dá)及其殺線蟲(chóng)活性研究學(xué)位申請(qǐng)人王俊偉指導(dǎo)教師孟慶玲副教授申請(qǐng)學(xué)位門類級(jí)別農(nóng)學(xué)碩士學(xué)科、專業(yè)名稱預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究方向分子寄生蟲(chóng)學(xué)所在學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院中國(guó)·新疆·石河子2013年6月Genecloning,expressionandanalysisofnematicidalactivityofinfectiousextracellularserineproteaseofArthrobotrysoligospor
2、aADissertationSubmittedtoShiheziUniversityInPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofAgricultureByWangjun-wei(MolecularParasitology)DissertationSupervisorProf.MengQing-lingJune,2013項(xiàng)目資助[1]項(xiàng)目名稱：綿羊消化道線蟲(chóng)病新型生物防控制劑研究；兵團(tuán)博士資金（2010JC09）。[2]項(xiàng)目名稱：少孢節(jié)叢孢菌侵染線蟲(chóng)分泌性蛋白功
3、能新基因研究；國(guó)家自然科學(xué)基金（31260601）。[3]項(xiàng)目名稱：少孢節(jié)叢孢菌捕食相關(guān)功能基因的克隆與表達(dá)研究；農(nóng)業(yè)公益行業(yè)專項(xiàng)子課題（201303037-5）。中文摘要家畜消化道線蟲(chóng)病是一類嚴(yán)重危害動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)持續(xù)健康發(fā)展的寄生蟲(chóng)疾病，每年給我國(guó)畜牧業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，對(duì)家畜消化道線蟲(chóng)病的防治主要依靠化學(xué)驅(qū)蟲(chóng)藥物，但長(zhǎng)期使用易使蟲(chóng)體產(chǎn)生抗藥性，降低藥效；同時(shí)，動(dòng)物性食品中的藥物殘留不但影響人類的身體健康還會(huì)對(duì)生態(tài)環(huán)境造成污染。為了克服化學(xué)藥物防控帶來(lái)的弊端，國(guó)內(nèi)外相繼開(kāi)展了家畜線蟲(chóng)病生物防控研究，通過(guò)線蟲(chóng)的天敵—捕食線蟲(chóng)性
4、真菌及其侵染線蟲(chóng)過(guò)程中分泌的毒力因子（胞外蛋白酶）來(lái)控制線蟲(chóng)病已經(jīng)顯示出巨大的應(yīng)用潛力，被認(rèn)為是一種人-動(dòng)物-環(huán)境友好型線蟲(chóng)病生物防控方法。因此，分離捕食線蟲(chóng)性真菌、研究其侵染線蟲(chóng)的胞外蛋白酶對(duì)于家畜消化道線蟲(chóng)病的科學(xué)防控具有重要意義。本研究以具有強(qiáng)捕食線蟲(chóng)活性的少孢節(jié)叢孢菌新疆分離株XJ-XAo1為研究對(duì)象，克隆了其侵染性絲氨酸蛋白酶XAoz1、P12和P186的基因，進(jìn)行了生物信息學(xué)分析；將絲氨酸蛋白酶XAoz1基因克隆入酵母表達(dá)載體中，在畢赤酵母系統(tǒng)誘導(dǎo)表達(dá)，對(duì)表達(dá)的重組蛋白酶開(kāi)展了殺線蟲(chóng)活性分析。該研究揭示了少孢節(jié)叢孢菌XJ
5、-XAo1株在侵染線蟲(chóng)過(guò)程中分泌的毒力因子X(jué)Aoz1的基因結(jié)構(gòu)特征，分析了重組蛋白酶reXAoz1酶學(xué)特性并測(cè)定了其殺線蟲(chóng)活性，為研制防控家畜消化道線蟲(chóng)病的新型蛋白酶噴灑生防制劑奠定了理論基礎(chǔ)。研究方法和主要結(jié)果如下：1.少孢節(jié)叢孢菌胞外絲氨酸類蛋白酶的基因克隆及序列分析：以捕食線蟲(chóng)性真菌少孢節(jié)叢孢菌新疆分離株XJ-XAo1為供試菌株，采用PCR方法成功克隆了XAoz1、P12和P186三個(gè)絲氨酸蛋白酶的DNA基因（GenBank登錄號(hào)分別為JF747254、JX898768和JX898769），并對(duì)基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，與國(guó)內(nèi)
6、外捕食線蟲(chóng)性真菌分離株進(jìn)行了序列同源性分析，構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果成功克隆了XAoz1（1344bp）、P12（1429bp）和P186（1468bp）的基因。XAoz1、P12各含1個(gè)內(nèi)含子，P186有3個(gè)內(nèi)含子，內(nèi)含子均以GT開(kāi)頭，AG結(jié)尾；它們都含有絲氨酸蛋白酶催化中心三聯(lián)體結(jié)構(gòu)域—XAoz1：Asp164、His203、Ser353，P12：Asp193、His230、Ser383，P186：Asp160、His192、Ser345；以及2個(gè)與底物結(jié)合的S1區(qū)—XAoz1：Ser259Leu260Gly261和Ala285A
7、la286Gly287，P12：Ser289Leu290Gly291和Ala315Ala316Gly317，P186：Ser251Leu252Gly253和Ala277Ala278Gly279。另外，還具有潛在的糖基化位點(diǎn)。XAoz1與已報(bào)道PII、Aoz1同源性高（97.5%、98.3%），親緣關(guān)系較近，提示XAoz1與PII、Aoz1可能是少孢節(jié)叢孢菌（A.oligospora）在不同環(huán)境條件下表達(dá)的同功酶或同源基因的類似物；P12、P186分別與PII、Aoz1親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，且XAoz1、P12、P186三者之間親緣關(guān)系也較遠(yuǎn)
8、。2.少孢節(jié)叢孢菌胞外絲氨酸蛋白酶XAoz1在畢赤酵母系統(tǒng)的表達(dá)：通過(guò)RT-PCR方法擴(kuò)增了XAoz1成熟肽的cDNA基因，用酶切方法構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-XAoz1，線性化后電擊轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主畢赤酵母GS115。結(jié)果經(jīng)過(guò)PC
