資源描述：
《利用反義rna技術調節(jié)木質素生物合成的研究new》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在教育資源-天天文庫。
1、首都師范大學碩士學位論文利用反義RNA技術調節(jié)木質素生物合成的研究——CCoAOMT和4CL基因對木質素生物合成的調控及C4H啟動子的分離與鑒定姓名：路靜申請學位級別：碩士專業(yè)：分子細胞生物學指導教師：何奕昆;宋艷茹20040601摘要木質素是一類酚類次生代謝產物，在植物體內行使重要的生理功能，但它卻是形成造紙污染的主要來源。利用基因工程手段，在分子水平調節(jié)木質素的生物合成，降低木質素的含量或改變組分以培育適合造紙的植物原料樹種具有較大的應用價值和環(huán)保效益。本研究利用反義RNA技術，主要圍繞木質素合成途徑中的咖啡酰輔酶A．O．甲基轉移酶(CCoAOMT)和4．香豆酸：輔酶
2、A連接酶(4CL)的基因調節(jié)植物木質素的生物合成，研究取得了如下進展：1_農桿菌介導法將CCoAOMT和4CL基因的反義表達載體導入毛白楊中。PCR—Southern、RT—PCR和Western雜交檢測結果顯示，兩個反義基因均已整合到毛白楊基因組DNA上，并在轉錄水平表達。通過分子生物學檢測手段對轉化植株進行篩選，獲得批量轉基因植株。Klason木質素含量測定分析表明，抑制內源CCoAOMT或4CL基因的表達，均能有效降低轉基因植物中的木質素含量，且不影響植株正常生長和發(fā)育以及碳水化合物的合成。研究中還發(fā)現(xiàn)，轉基因毛白楊的莖桿上一些區(qū)域呈紅棕色，顏色的深淺與轉基因毛白楊
3、木質素含量的下降幅度呈一定的正相關，因此，顏色變化可作為轉基因植株篩選的一個輔助指標。已篩選出木質素含量下降10％以上的轉CCoAi：馳[T基因毛白楊株系8個，最多降低26．20％；獲得木質素含量下降10％以上的轉4CL基因株系3個，下降最多達41．73％，可用于中試與制漿實驗。該研究結果為培育低木質素環(huán)保型毛白楊提供理論與實踐依據(jù)，也為從源頭治理造紙廢水污染奠定了基礎。2．為了優(yōu)化現(xiàn)有的表達框架，使目的基因更有效地調節(jié)木質素的生物合成，應用PCR技術從毛白楊(Populustomentosa)基因組中分離得到木質素合成相關酶一肉掛酸一4一羥化酶(C4H)基因啟動予片段(
4、GenBank注冊號：AY351673)。測序結果表明該啟動子片段長1117bp，與雜交顫楊(Pkitakamiensis)C4H5’非翻譯區(qū)的上游片段同源性為94％。序列分析結果表明，該啟動子包含轉錄因子MYB的結合位點CACCAACC和轉錄因子Myb26結合位點GTTAGGTT等保守序列，這與C4H參與苯丙酸代謝合成途徑的生物學功能相吻合。GUS熒光活性分析和組織化學染色結果顯示，該啟動子在木質化的組織和器官中特異表達，隨著組織成熟度和木質化程度的增加，表達活性逐漸增強，并且該啟動予受傷誘導表達。反義CCbAOMT基因在C4H啟動子的調控下，使得轉基因煙草木質素含量有
5、不同程度的減少，且并不影響碳向碳水化合物的轉換合成，對植物的生長發(fā)育也無明顯負效應。這些結果證明了從毛白楊中分離的C4H啟動子可以應用于造紙原料樹種材性改良的遺傳工程操作。關鍵詞：木質素生物合成反義RNAC4H啟動子制漿造紙UAbstractLigninisaphenolicpolymerandplaysimportantrolesinplants，butisthemainresourceofpapermakingpollution．Thusthereisofeconomicalandenvironmentalinterestsincultivatingmaterials
6、withgeneticallymodifiedligninforpulpingindustry．TheeffectsofdownregulationoftwoligninrelatedgenesCCoAOMTand4CLexpressiononligninbiosyntheisisWerestudiedusingantisenseRNAtechniquesinthispaper．Thefollowingpresentsthemainpmgress：1．TwoantisenseexpressionvectorscontainingthecDNAofCCoAOMTor4CLg
7、enesweretransferredintoChinesewhitepoplarsmediatedbyAgrobacteriumtumefacience．PCR·SouthernanalysisindicatedthatantisensecDNAsintegratedintothegenomeofthetransgenicpoplars．TheantisensegenesexpressedattranscriptionalandtranslationalleveldisplayedbyRT-PCRandWesternbloa
