青藤堿對(duì)rankl和lps誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞的影響及作用機(jī)制研究

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1、博士學(xué)位論文南方醫(yī)科大學(xué)2010級(jí)博士學(xué)位論文青藤堿對(duì)RANKL和LPS誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞的影響及作用機(jī)制研究EffectsofSinomenineonRANKL—inducedandLPS—inducedOSteoclastandtherelativemechanisms課題來(lái)源：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81073119，30801413)學(xué)位申請(qǐng)人導(dǎo)師姓名專業(yè)名稱培養(yǎng)類型培養(yǎng)層次所在學(xué)院賀龍剛劉叔文藥理學(xué)學(xué)術(shù)型博士研究生藥學(xué)院2013年5月20日廣州博士學(xué)位論文青藤堿對(duì)RANKL和LPS誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞的影響及作用機(jī)制研究博士研究生：賀龍剛指導(dǎo)教師：劉叔文教授摘要骨代謝的穩(wěn)定需要破骨細(xì)胞(os

2、teoclasts，OCs)介導(dǎo)的骨吸收和成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成作用間的動(dòng)態(tài)平衡和偶聯(lián)，在健康個(gè)體中，二者維持功能平衡，而平衡一旦打破則可能導(dǎo)致骨骼疾病的發(fā)生。骨破壞主要是由異常的OCs活化造成的，過(guò)度骨破壞可能導(dǎo)致一些常見(jiàn)疾病，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、骨髓炎、牙周炎等。目前對(duì)于這些疾病的藥物治療相當(dāng)有限，主要依賴于糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、抗生素或非甾體抗炎藥，然而這些藥物不能逆轉(zhuǎn)骨質(zhì)侵蝕，有的甚至有反作用。OCs是體內(nèi)唯一負(fù)責(zé)骨吸收的細(xì)胞，靶向抑制OCs活化被認(rèn)為是逆轉(zhuǎn)骨破壞最有效、最直接的治療策略，目前已經(jīng)成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。OCs起源于骨髓單核．巨噬細(xì)胞譜系細(xì)胞，在體內(nèi)必須依賴于一

3、些誘因誘導(dǎo)分化發(fā)育為多核的成熟OCs。目前認(rèn)為最直接活化OCs的內(nèi)源性分子是激活核因子NF．v．B受體的配體(receptoractivatorofnuclearkappaBligand，RANKL)。RANKL通過(guò)和OCs膜上受體RANK結(jié)合，募集形成TRAF6和c．Src復(fù)合體，激活下游信號(hào)通路(NF．rJ3、MAPK和Ca2+通路)通過(guò)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑激活核轉(zhuǎn)錄因子NF．r,B、AP．1和NFATcl，激活OCs相關(guān)基因表達(dá)，例如抗酒石酸堿性磷酸酶(tartrateresistantacidphosphatase，TRACP)，金屬基質(zhì)蛋白酶9(matrixmetalloprotei

4、nase．9，MMP．9)，整合素p3(integrinl33)和組織蛋白酶K(cathepsinK)，促進(jìn)OCs分化，增強(qiáng)骨吸收活性，抑制其凋亡，最終導(dǎo)致OCs數(shù)量增多、功能亢進(jìn)。脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)被認(rèn)為是導(dǎo)致慢性G一菌感染骨丟失的最中文摘要主要介質(zhì)，被認(rèn)為與誘導(dǎo)OCs活化密切相關(guān)，其誘導(dǎo)機(jī)制目前認(rèn)為包括：通過(guò)誘導(dǎo)成骨細(xì)胞中RANKL的表達(dá)來(lái)控制OCs的分化和激活；通過(guò)刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF—a，IL—l和IL一6等炎癥因子以及延長(zhǎng)OCs的生命周期。青藤堿是傳統(tǒng)抗風(fēng)濕中藥青風(fēng)藤中的主要活性成分。具有明顯抗風(fēng)濕、抗炎、免疫抑制等藥理作用。其相關(guān)制劑在臨床

5、上對(duì)各種風(fēng)濕病具有確切療效。盡管相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)青藤堿具有降低骨破壞程度的效果，但是否能調(diào)控OCs仍未見(jiàn)有報(bào)道。本課題以青藤堿為研究對(duì)象，利用體外RANKL和LPS誘導(dǎo)OCs體系及體內(nèi)Mt誘導(dǎo)的佐劑性關(guān)節(jié)炎骨破壞模型和LPS誘導(dǎo)的急性顱骨骨破壞模型，探討青藤堿對(duì)OCs的調(diào)節(jié)作用及分子機(jī)制。主要內(nèi)容包括三部分：1．青藤堿對(duì)RANKL誘導(dǎo)的OCs的影響；2．青藤堿對(duì)RANKL誘導(dǎo)的OCs的作用機(jī)制；3．青藤堿對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW二OCL的影響及機(jī)制。實(shí)驗(yàn)方法：1)通過(guò)CellTiter．Glo法和CCK．8法考察不同濃度青藤堿(0．125、0．25、0．5、lmM)干預(yù)不同時(shí)間(6h、24h、48

6、h、5d)對(duì)RAW264．7細(xì)胞的生存影響，確定合適的體外用藥濃度。利用體外RANKL誘導(dǎo)RAW264．7細(xì)胞形成OCs體系，通過(guò)TRACP染色計(jì)數(shù)評(píng)價(jià)青藤堿(O．25、0．5、1mM)對(duì)OCs形成和生存的影響；通過(guò)骨片吸收實(shí)驗(yàn)對(duì)骨凹陷和骨吸收面積統(tǒng)計(jì)分析評(píng)價(jià)青藤堿(0．5、lmM)3天內(nèi)對(duì)成熟OCs骨吸收功能的影響；利用標(biāo)記FITC的鬼筆環(huán)肽染色評(píng)價(jià)青藤堿(1mM)6h內(nèi)對(duì)OCs肌動(dòng)蛋白環(huán)結(jié)構(gòu)的影響；采用Real．TimePCR技術(shù)，檢測(cè)青藤堿(0．25、0．5、1mM)對(duì)RANKL誘導(dǎo)的RAW264．7細(xì)胞相關(guān)基因TRACP，MMP一9，c—Sre，Integrin133和cathep

7、sinK表達(dá)水平的影響。建立Mt誘導(dǎo)的佐劑性關(guān)節(jié)炎sD大鼠骨破壞模型，評(píng)價(jià)青藤堿(i．p．80mg／kg／day)和陽(yáng)性藥物雷公藤多甙片(i．g．2．5mg／kg／day)對(duì)模型動(dòng)物足踝腫脹、骨破壞病理變化、OCs數(shù)量、骨參數(shù)(組織礦物質(zhì)密度、骨礦物質(zhì)密度、骨體積分?jǐn)?shù)、骨小梁厚度、骨小梁數(shù)量，骨小梁分離度)及血清中相關(guān)細(xì)胞因子RANKL、骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)、TRACP5b和堿性磷酸酶(al