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《rna干擾技術(shù)抑制成骨細(xì)胞rankl基因?qū)Y(jié)核因子誘導(dǎo)破骨細(xì)胞生成的影響》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、RNA干擾技術(shù)抑制成骨細(xì)胞RANKL基因?qū)Y(jié)核因子誘導(dǎo)破骨細(xì)胞生成的影響張?jiān)ダ罾?通訊作者)(新疆自治區(qū)人民醫(yī)院脊柱外科830000)【摘要】A的利用RNA干擾(RNAi)技術(shù)抑制小鼠成骨細(xì)胞核激活因子受體配體(LigandofreceptoractivatorofNF-JB,RANKL)的表達(dá)，觀察成骨細(xì)胞RANKL/OPG比值的變化，探討成骨細(xì)胞與結(jié)核因子誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成的相關(guān)性。方法合成4條RANKL序列特異性小干擾RNA(siRNA),用Liopfectamin2000轉(zhuǎn)染成骨細(xì)胞，采用熒光實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)RANKL的表達(dá)，篩選出最有效的干擾序列，并用We
2、sternblot技術(shù)檢測(cè)成骨細(xì)胞的RANKL、OPG的表達(dá)，觀察RANKL/OPG比例的變化，采用成骨細(xì)胞破骨細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù)探討轉(zhuǎn)染后的成骨細(xì)胞對(duì)由結(jié)核因子誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成的影響。結(jié)果合成的4對(duì)siRNA屮有一對(duì)可使小鼠成骨細(xì)胞的RANKLmRNA水平下降80%,蛋白表達(dá)下降72%;同時(shí)OPG的蛋白表達(dá)無明顯變化,RANKL/OPG比例明顯丁調(diào)，破骨細(xì)胞的生成明顯受到抑制。結(jié)論RNAi沉默RANKL基因表達(dá)可顯著K調(diào)成骨細(xì)胞RANKL/OPG的比值，抑制由結(jié)核因子所誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成。【關(guān)鍵詞】核激活因子受體配體RNA干擾小鼠成骨細(xì)胞基因沉默【屮圖分類號(hào)】R39【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A【文
3、章編號(hào)】2095-1752(2013)23-0092-02RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)是破骨細(xì)胞分化激活最重要的信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)。成骨/基質(zhì)細(xì)胞膜上表達(dá)的RANKL分子與破骨細(xì)胞前體細(xì)胞膜上RANK結(jié)合，刺激破骨細(xì)胞前體發(fā)育。成骨細(xì)胞還可分泌OPG,能競(jìng)爭(zhēng)性與RANKL結(jié)合,因此可以抑制破骨細(xì)胞生成[1],是極具發(fā)展前途的基因治療靶位。1998年來逐漸發(fā)展成熟的RNA干擾(RNAinterference,RNAi)技術(shù)是一種十分有潛力的基因功能研究和基因治療方法，它是通過小干擾RNA(smallinterferingRNA,siRNA)觸發(fā)的序列特異性mRNA降解所致的基因沉默方法[2
4、],較其他基因抑制的方法具奮高效、特異、快速、容易操作等優(yōu)點(diǎn)。本研究利用RNAi技術(shù)降低成骨細(xì)胞RANKL的表達(dá)，觀察其是否可以阻止結(jié)核因子所誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞的形成，探討骨關(guān)節(jié)結(jié)核的發(fā)病機(jī)制及相應(yīng)治療上的新思路。1材料與方法1.1主要試劑:小牛血清（GiBco公司）,DMEM（DulbeccopsmodifiedEaglepsmedium）培養(yǎng)基（GIBCO公司）,A-MEM培養(yǎng)基（GIBCO公司）,脂質(zhì)LipofectAMINE2000（美國(guó)Invitrogen公司），抗小鼠RANKL抗體（SantaCruz公司）,抗小鼠OPG抗體（武漢博士德公司）。1.2成骨細(xì)胞的培養(yǎng):取新生2d的
5、Balb/c小鼠5只，引頸處死,75%乙醇浸泡消毒5min。無菌條件下取顱骨，仔細(xì)剝離骨膜和周圍組織。加入0.25%胰蛋白酶5ml室溫消化5?lOmin。用含小牛血清的DMEM培養(yǎng)基洗滌2?3次。剪碎至lmm3大小,接種于培養(yǎng)瓶。每2?3d更換培養(yǎng)液,待細(xì)胞生長(zhǎng)完全覆蓋瓶底后開始傳代。實(shí)驗(yàn)采用3?5代的成骨細(xì)胞。1.3siRNA的合成篩選:GenBank中檢索Bab/c小鼠全長(zhǎng)的RANKL基因序列，根據(jù)http://wwwambioncom/echlib/misc/siRNAfinderhtml設(shè)計(jì)4對(duì)針對(duì)RANKL的siRNA如下:siRNAl5—3-GTGTGCACCATCGCTC
6、AGTdTdT,反義鏈ACAGAGCGAUGCUGCAGACdTdT;siRNA25—3-GACTCGACTCTGGAGAGTGdTdT,反義鏈CACUCUCCAGAGUCGAGUCdTdT;siRNA35-—3-GCTCCAGCTATGATGGAAGdTdT,反義鏈CUUCCAUCAUAGCUGGAGCdTdT;siRNA45-—3-ACTCTGTCCTCTTGGTAGCdTdT,反義鏈GGTACCAAGAGGACAGAGUdTdT;陰十生X寸，照、5cy3cUUCUCCGAACGUGUCACGUTTZ反義鏈ACGUGACACGUUCGGAGAATT。siRNA的合成委托上海生物工程
7、技術(shù)有限公司完成。轉(zhuǎn)染前Id將培養(yǎng)好的Balb/c小鼠成骨細(xì)胞按3×105/孔接種在6孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞密度達(dá)70%?80%吋用Lipofectin2000TM將siRNA轉(zhuǎn)染入細(xì)胞。siRNA的轉(zhuǎn)染終濃度為187nmol/L。轉(zhuǎn)染方法按照Lipofectin2000TM說明書操作，空白對(duì)照組僅用無血清培養(yǎng)基,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。轉(zhuǎn)染后48h提取細(xì)胞總RNA,用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）篩選1對(duì)最?yuàn)^效的siRNA,進(jìn)
