體外大鼠成骨細(xì)胞對(duì)破骨細(xì)胞形成的影響

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1、體外大鼠成骨細(xì)胞對(duì)破骨細(xì)胞形成的影響【摘要】目的通過將鼠成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞直接共培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)方法，研究成骨細(xì)胞對(duì)破骨細(xì)胞分化及功能成熟的影響。方法按照MCSF30μg/L、RANKL50μg/L的濃度對(duì)鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)6d，與原代培養(yǎng)3d的鼠成骨細(xì)胞按細(xì)胞數(shù)量1∶1直接共培養(yǎng)，加入1,25(OH)2D31×10-8mol/L和PGE21×10-6mol/L，利用形態(tài)學(xué)觀察、TRAP染色、骨吸收陷窩檢測(cè)等方法對(duì)共培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行鑒定。結(jié)果成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，成骨細(xì)胞有明顯的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)；染色后顯微鏡下可見大量呈單層排列的成骨細(xì)胞，偶見TRAP(+)的破骨細(xì)胞。結(jié)論成骨細(xì)胞對(duì)破骨細(xì)胞分化

2、及功能成熟的影響與兩者的相對(duì)數(shù)量有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中，由于成骨細(xì)胞快速生長(zhǎng)，當(dāng)其數(shù)量多于破骨細(xì)胞時(shí)，可能使1,25(OH)2D3對(duì)成骨細(xì)胞RANKL表達(dá)的上調(diào)作用不足，且PGE2對(duì)成骨細(xì)胞OPG表達(dá)的下調(diào)作用不足，從而主要表現(xiàn)為對(duì)破骨細(xì)胞形成及分化的抑制作用。【關(guān)鍵詞】破骨細(xì)胞成骨細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)RANKLMCSF　　ABSTRACT:ObjectiveByculturingtheosteoclaststogetherationofmatureosteoclasts.MethodsThebonemarroononuclearcellsofratsaryosteoblastsequantityasth

3、eosteoclasts,ol/LandPGE21×10-6mol/L.Themorphologicalobservation,TRAPstainingandpitstainingaryosteoblasts,thegroorepreponderances.Afterstaining,oreosteoblaststhanosteoclasts.ConclusionTherelationshipbetberosteoclasts,osteoblastsationanddifferentiationofosteoclasts.　　KEYCSF　　正畸牙齒移動(dòng)是伴隨著牙槽骨的吸收和形成過程而發(fā)生的

4、，牙槽骨的吸收是牙齒移動(dòng)的第一步，成熟的破骨細(xì)胞(osteoclasts,OC)則是唯一能行使骨吸收功能的細(xì)胞[1]。當(dāng)牙槽骨受到應(yīng)力或其他刺激因素時(shí)，骨組織內(nèi)發(fā)出一定信號(hào)，通過骨的微管腔隙傳至骨表面的上皮細(xì)胞，上皮細(xì)胞再將這些信號(hào)傳達(dá)出去，引導(dǎo)外周血中OC的祖細(xì)胞向患處定向游動(dòng)、聚集，大量聚集于此處的破骨細(xì)胞前體細(xì)胞(preosteoclasts,pOC)與此處的成骨細(xì)胞(osteoblasts,OB)接觸后開始分化為成熟的OC，并激活該細(xì)胞行使骨吸收的功能[24]。OB與OC之間的這種相互作用是與二者的相對(duì)數(shù)量有關(guān)的。因此，本實(shí)驗(yàn)擬通過建立OB和OC的直接共培養(yǎng)模型，觀察OB對(duì)OC分化及

5、功能成熟的調(diào)節(jié)作用?！　?材料與方法　　1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑4周齡SD雄性大鼠2只和出生1-2d的SD大鼠2只均由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。主要試劑：αMEM培養(yǎng)基由美國(guó)GIBCO公司提供；胎牛血清由灝洋生物有限公司提供；細(xì)胞分離液Histopaque1083、巨噬細(xì)胞集落刺激因子MCSF、破骨細(xì)胞分化因子ODF/RANKL、萘酚ASBI磷酸鹽、N，N二甲基酰胺均由美國(guó)Sigma公司提供?！　?.2玻片及牙本質(zhì)片的制備將4mm×4mm蓋玻片經(jīng)超聲清洗后浸入硫酸重鉻酸鉀溶液中過夜，充分水洗烤干，高壓滅菌后備用。取因正畸矯治需要拔除的健康牙，去除冠部釉質(zhì)，冷凍后制備4mm×4

6、mm、厚100-200μm的牙本質(zhì)片，蒸餾水中超聲清洗10min×3次，置于75%(體積分?jǐn)?shù))乙醇中，4℃保存?zhèn)溆?，使用前在超凈臺(tái)中紫外燈照射消毒?！　?.3OC的培養(yǎng)按照常規(guī)方法分離出鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞，用αMEM全培養(yǎng)液[含15%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清、青霉素100u/mL、鏈霉素100μg/mL]重懸，加入MCSF(10μg/L)，分置于兩個(gè)25cm2培養(yǎng)瓶中，37℃、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h。24h后，收集細(xì)胞懸液，離心，PBS清洗，Histopaque分離液分離單個(gè)核細(xì)胞，再用αMEM全培養(yǎng)液制備細(xì)胞懸液(2×106個(gè)細(xì)胞/mL)。在兩個(gè)預(yù)置蓋玻片的96孔培養(yǎng)板內(nèi)加入

7、細(xì)胞懸液后，每孔中再加入含MCSF30μg/L，RANKL50μg/L的培養(yǎng)液50μL，37℃、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)備用，每3d換液一次?！　?.4OB的原代培養(yǎng)[5]在OC培養(yǎng)的第3天，取出生后1-2d的SD大鼠2只，拉頸處死后在75%(體積分?jǐn)?shù))的乙醇溶液中浸泡3-5min。無菌條件下，取顱蓋骨(扁骨)，放入DHanks液中。去除骨膜及周圍結(jié)締組織，將其置于盛有αMEM全培