煙草浸提液對(duì)大鼠體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞的影響論文

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1、煙草浸提液對(duì)大鼠體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞的影響論文王桂龍侯玉東石玲波【摘要】目的探索煙草浸提液對(duì)體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞的附著和生長的影響。方法將周齡SD大鼠顱蓋骨，剪成1.5mm×1.5mm大小組織塊，先用0.25％胰蛋白酶消化20min、0.1％Ⅱ型膠原酶消化30min后，再對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，并對(duì)其堿性磷酸酶(ALP)活性及礦化能力進(jìn)行鑒定。實(shí)驗(yàn)分對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組按所加煙草浸提液濃度的不同分為0.8、1.6、3.2、6.4、12.5、25和50g／L7個(gè)濃度組，分別測(cè)定各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的生長曲線

2、。采用SPSS13.0軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行雙因素方差分析。結(jié)果煙草浸體液對(duì)成骨細(xì)胞的附著和生長起抑制作用，并隨其濃度的升高而增強(qiáng)。各處理組間存在顯著差異（P＜0.01）；各組內(nèi)的前3d存在顯著性差異（P＜0.01）.freelokelesstobaccoextract(ST)ontheattachmentandgrothecalvariainratsaged1m×1.5mm.Theyinutesandby0.1％collagenaseIIfor30minutesandthentheliquidsupernat

3、antorphology,histochemicalstainingofalkalinephosphatase(ALPase)andcalcifiednodulesstaining.Theexperimentsentgroups.Theexperimentgroupsokelesstobaccoextract’sconcentration:0.8,1.6,3.2,6.4,12.5,25and50g／L,thenthecellgroedusingSPSS13.0softentandgroanner.The

4、differenceamongallofgroupsegroupong3.250g／Lgroupsokingisharmfultotheclinichealingoforalimplantoperation.【Keyaryculture,rats,smokelesstobaccoextract目前，口腔種植技術(shù)因其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)而獲得了臨床醫(yī)師及患者的青睞，而骨結(jié)合則是其成功的基礎(chǔ)。骨組織作為一種特殊的鈣化組織，主要由成骨細(xì)胞完成并受體內(nèi)多種因素調(diào)控。隨著細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，成骨細(xì)胞的體外培養(yǎng)成為可能。體外

5、培養(yǎng)的成骨細(xì)胞可以排除體內(nèi)多種因素的相互影響，從而為骨形成和代謝機(jī)理方面的研究提供有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。目前成骨細(xì)胞原代培養(yǎng)的方法主要有2種：酶消化法和組織塊法［1,2］。酶消化法雖可獲得大量細(xì)胞，但獲得的細(xì)胞不純。本實(shí)驗(yàn)擬采用酶消化后再對(duì)組織塊進(jìn)行培養(yǎng)的方法來獲得純度較高的成骨細(xì)胞，觀察煙草浸提液對(duì)成骨細(xì)胞的附著及生長的影響，以期證明吸煙是影響口腔種植的不利因素之一。1材料和方法1.1器材和試劑1.1.1主要儀器設(shè)備和材料:超凈工作臺(tái)(蘇州集團(tuán)安泰公司)；CO2培養(yǎng)箱(Heraeus)；熒光倒置顯微鏡(日本

6、OLYMLOS)；眼科手術(shù)器械（上海手術(shù)器械廠）；血球計(jì)數(shù)板（鎮(zhèn)江市丹徒科達(dá)醫(yī)療用品廠）；50ml玻璃培養(yǎng)瓶（Costar）；離心機(jī)（雷動(dòng)爾LDZ52）；高糖DMEM（Ｇibco）；胰蛋白酶（Amresco）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料研究所）；膠原酶（Invitrogen）；煙草（成品盒裝香煙，煙氣煙堿量1.2mg，焦油量13mg）；SD大鼠（煙臺(tái)綠葉實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）。1.1.2主要試劑的配制:①含煙草浸提液培養(yǎng)液的配制［3］:稱取5g成品盒裝香煙的煙絲，加入0.1L的雙蒸水，在37℃孵育箱中浸泡

7、48h，過濾除菌，將此濃度定為50g／L。用含15ml／L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配制含煙草浸提液的培養(yǎng)液，其濃度分別為0.8、1.6、3.2、6.4、12.5、25和50g／L7個(gè)濃度組。②成骨細(xì)胞礦化培養(yǎng)液的配制:DMEM培養(yǎng)基中加入雙抗(含青霉素100U/ml、鏈霉素100U/ml)、10%胎牛血清、Na2CO3。含礦化液的DMEM培養(yǎng)基中加入雙抗(含青霉素100U/ml、鏈霉素100U/ml)、10%胎牛血清、Na2CO3、β甘油磷酸鈉1×10-2mol/L、維生素C50mg/ml、地塞米松1×

8、10-7mol/L。孵育液含3%β甘油磷酸鈉5ml，2%巴比妥鈉5ml，2%硝酸鈣10ml，2%MgSO45ml，蒸餾水25ml。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1大鼠成骨細(xì)胞的原代培養(yǎng)：周齡SD大鼠處死后用75％酒精浸泡5min，倒置顯微鏡下取其顱頂骨，以無菌DHanks(含青霉素100U/ml、鏈霉素100U/ml)沖洗，刮去骨膜、剪去骨縫間結(jié)締組織，制成約1.5mm×1.5mm大小的碎塊，以DHanks液沖洗3次，加入0.2