體外大鼠成骨細胞對破骨細胞形成的影響

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1、體外大鼠成骨細胞對破骨細胞形成的影響【摘要】目的通過將鼠成骨細胞與破骨細胞直接共培養(yǎng)的實驗方法，研究成骨細胞對破骨細胞分化及功能成熟的影響。方法按照MCSF30μg/L、RANKL50μg/L的濃度對鼠骨髓單個核細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)6d，與原代培養(yǎng)3d的鼠成骨細胞按細胞數(shù)量1∶1直接共培養(yǎng)，加入1,25(OH)2D31×10-8mol/L和PGE21×10-6mol/L，利用形態(tài)學(xué)觀察、TRAP染色、骨吸收陷窩檢測等方法對共培養(yǎng)細胞進行鑒定。結(jié)果成骨細胞與破骨細胞共培養(yǎng)時，成骨細胞有明顯的生長優(yōu)勢；染色后顯微鏡下可見大量呈單層排列的成骨細胞，偶見TRAP(+)的破骨細胞。結(jié)論成骨細胞對破骨細胞分化

2、及功能成熟的影響與兩者的相對數(shù)量有關(guān)。本實驗中，由于成骨細胞快速生長，當(dāng)其數(shù)量多于破骨細胞時，可能使1,25(OH)2D3對成骨細胞RANKL表達的上調(diào)作用不足，且PGE2對成骨細胞OPG表達的下調(diào)作用不足，從而主要表現(xiàn)為對破骨細胞形成及分化的抑制作用?！娟P(guān)鍵詞】破骨細胞成骨細胞細胞培養(yǎng)RANKLMCSF　　ABSTRACT:ObjectiveByculturingtheosteoclaststogetherationofmatureosteoclasts.MethodsThebonemarroononuclearcellsofratsaryosteoblastsequantityasth

3、eosteoclasts,ol/LandPGE21×10-6mol/L.Themorphologicalobservation,TRAPstainingandpitstainingaryosteoblasts,thegroorepreponderances.Afterstaining,oreosteoblaststhanosteoclasts.ConclusionTherelationshipbetberosteoclasts,osteoblastsationanddifferentiationofosteoclasts.　　KEYCSF　　正畸牙齒移動是伴隨著牙槽骨的吸收和形成過程而發(fā)生的

4、，牙槽骨的吸收是牙齒移動的第一步，成熟的破骨細胞(osteoclasts,OC)則是唯一能行使骨吸收功能的細胞[1]。當(dāng)牙槽骨受到應(yīng)力或其他刺激因素時，骨組織內(nèi)發(fā)出一定信號，通過骨的微管腔隙傳至骨表面的上皮細胞，上皮細胞再將這些信號傳達出去，引導(dǎo)外周血中OC的祖細胞向患處定向游動、聚集，大量聚集于此處的破骨細胞前體細胞(preosteoclasts,pOC)與此處的成骨細胞(osteoblasts,OB)接觸后開始分化為成熟的OC，并激活該細胞行使骨吸收的功能[24]。OB與OC之間的這種相互作用是與二者的相對數(shù)量有關(guān)的。因此，本實驗擬通過建立OB和OC的直接共培養(yǎng)模型，觀察OB對OC分化及

5、功能成熟的調(diào)節(jié)作用?！　?材料與方法　　1.1實驗動物和試劑4周齡SD雄性大鼠2只和出生1-2d的SD大鼠2只均由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。主要試劑：αMEM培養(yǎng)基由美國GIBCO公司提供；胎牛血清由灝洋生物有限公司提供；細胞分離液Histopaque1083、巨噬細胞集落刺激因子MCSF、破骨細胞分化因子ODF/RANKL、萘酚ASBI磷酸鹽、N，N二甲基酰胺均由美國Sigma公司提供?！　?.2玻片及牙本質(zhì)片的制備將4mm×4mm蓋玻片經(jīng)超聲清洗后浸入硫酸重鉻酸鉀溶液中過夜，充分水洗烤干，高壓滅菌后備用。取因正畸矯治需要拔除的健康牙，去除冠部釉質(zhì)，冷凍后制備4mm×4

6、mm、厚100-200μm的牙本質(zhì)片，蒸餾水中超聲清洗10min×3次，置于75%(體積分?jǐn)?shù))乙醇中，4℃保存?zhèn)溆?，使用前在超凈臺中紫外燈照射消毒?！　?.3OC的培養(yǎng)按照常規(guī)方法分離出鼠骨髓基質(zhì)細胞，用αMEM全培養(yǎng)液[含15%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清、青霉素100u/mL、鏈霉素100μg/mL]重懸，加入MCSF(10μg/L)，分置于兩個25cm2培養(yǎng)瓶中，37℃、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h。24h后，收集細胞懸液，離心，PBS清洗，Histopaque分離液分離單個核細胞，再用αMEM全培養(yǎng)液制備細胞懸液(2×106個細胞/mL)。在兩個預(yù)置蓋玻片的96孔培養(yǎng)板內(nèi)加入

7、細胞懸液后，每孔中再加入含MCSF30μg/L，RANKL50μg/L的培養(yǎng)液50μL，37℃、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)備用，每3d換液一次。　　1.4OB的原代培養(yǎng)[5]在OC培養(yǎng)的第3天，取出生后1-2d的SD大鼠2只，拉頸處死后在75%(體積分?jǐn)?shù))的乙醇溶液中浸泡3-5min。無菌條件下，取顱蓋骨(扁骨)，放入DHanks液中。去除骨膜及周圍結(jié)締組織，將其置于盛有αMEM全培