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1、第22卷第2期國外醫(yī)學(xué)·生理、病理科學(xué)與臨床分冊Vol.22No.22002年4月ForeignMedicalSciences·SectionofPathophysiologyandClinicalMedicineApr.2002①雙向電泳技術(shù)原理及其應(yīng)用劉上峰 傅俊江 綜述 李麓蕓 審校(中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院人類生殖工程研究室,湖南長沙410078)摘要:雙向電泳技術(shù)是蛋白質(zhì)組研究的核心技術(shù)之一,本文對其基本原理、分辨率、可重復(fù)性、相關(guān)數(shù)據(jù)庫、減法分析等作了介紹,并對其今后的發(fā)展方向作了展望。關(guān)鍵詞:雙向電泳; 蛋白質(zhì)組; 數(shù)據(jù)庫; 減
2、法分析中圖分類號:R318133 文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A 文章編號:100121773(2002)0220197203 隨著后基因組時代的到來,蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)運(yùn)而[2]點(diǎn),一般的22DE能分辨1000～3000個蛋白質(zhì)點(diǎn)。生。雙向電泳(two2dimensionalelectrophoresis,22DE)常用改善分辨率的主要措施有:應(yīng)用復(fù)雜的兩作為蛋白質(zhì)組研究的三大關(guān)鍵核心技術(shù)之一(另二性電解質(zhì),減少凝膠厚度(1.5～0.5mm)以及增大凝種是質(zhì)譜技術(shù)和計(jì)算機(jī)圖像數(shù)據(jù)處理與蛋白質(zhì)組數(shù)[3]膠面積(30cm～40cm)。Humphery2Sm
3、ith等創(chuàng)立了據(jù)庫即蛋白質(zhì)組信息學(xué)),仍然是目前分析組份復(fù)雜蛋白質(zhì)組重疊群(proteomiccontig)來提高分辨率,即蛋白質(zhì)分辨率最高的工具,因此日益受到人們的廣利用多塊不同pH梯度和/或分子量上相互重疊的雙泛關(guān)注。向電泳圖譜,拼接成一張完整的雙向電泳圖譜。但1 雙向電泳的基本原理因細(xì)胞內(nèi)含有3～5萬種蛋白質(zhì),遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足需首先根據(jù)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)不同在pH梯度膠中等要。盡管在膜蛋白制備和雙向電泳pH梯度范圍擴(kuò)電聚焦(isoelectricfocusing,IEF)將其分離,然后按照[4～6]展上有了較大改進(jìn),應(yīng)用極窄pH梯度膠分離蛋它
4、們的分子量大小在垂直方向或水平方向進(jìn)行十二[7]白質(zhì)組已有報(bào)道,但對細(xì)胞內(nèi)的低拷貝蛋白、極端烷基磺酸鈉2聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS2PAGE)第二酸性或堿性蛋白、分子量過大或過小蛋白、難溶蛋白次分離。(包括膜蛋白)等的電泳分離和檢測仍面臨很大困根據(jù)第一向等電聚焦條件的不同,可將22DE分難。要真正解決此問題還需進(jìn)一步研究。為三種系統(tǒng):第一種系統(tǒng)是在聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)2.2 可重復(fù)性 為提高22DE凝膠的重復(fù)性,引行,兩性電解質(zhì)在外加電場作用下形成梯度,該系統(tǒng)[8]入了固定的載體兩性電解質(zhì)Immobiline,可是由稱為ISO2DALT。
5、其主要缺點(diǎn)是pH梯度不穩(wěn)定,重Immobiline222DE凝膠難以獲得同等的重復(fù)性數(shù)據(jù),復(fù)性差,上樣量低,不利于不同實(shí)驗(yàn)室間進(jìn)行圖譜比[10]實(shí)驗(yàn)表明,雖然其蛋白質(zhì)點(diǎn)相對位置有較好的重較;如果第一向電泳使用丙烯酰胺和Immobilines共復(fù)性,但其蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)最多可相差500多點(diǎn)。通過聚,形成具有pH梯度的凝膠,這種系統(tǒng)稱為IPG2簡化程序可以提高重復(fù)性,例如省去濃縮膠,在第二DALT系統(tǒng),該系統(tǒng)pH梯度穩(wěn)定,不依賴于外加電向電泳中使用連續(xù)的分離膠等。在得到高質(zhì)量的可場,基本上克服了ISO2DALT的主要缺點(diǎn),無論是重重復(fù)的電泳圖譜中,
6、實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)也是非常重要的。對[10,11]復(fù)性和上樣量均優(yōu)于ISO2DALT;第三種是非平衡pH整個22DE過程的自動化已經(jīng)做了初步嘗試。梯度電泳(nonequilibriumpHgradientelectrophoresis,2.3 染色 常用蛋白質(zhì)點(diǎn)的染色方法有銀染、熒NEPhGE),主要用于分離堿性蛋白質(zhì),電泳展開時間光染料、氨基黑、印度墨等。銀染法靈敏度高,可以相對比較短。在蛋白質(zhì)中找到含量較低的蛋白,且所需的上樣量2 雙向電泳的技術(shù)特點(diǎn)及存在的問題較少(每點(diǎn)僅需0.1ng)。但銀染法也有許多缺點(diǎn),2.1 分辨率 雙向電泳分辨率
7、高。自Smithies如一些條帶的可重復(fù)性差,動力學(xué)范圍較小,一些普[1]等第一次應(yīng)用22DE分離蛋白質(zhì)以來,這種技術(shù)的通的蛋白質(zhì)染色較差甚至根本沒有,并且銀染法很分辨率已從15個蛋白質(zhì)點(diǎn)發(fā)展到10000個蛋白質(zhì)費(fèi)人力,對以后的質(zhì)譜測定也有干擾。與此相比,熒①收稿日期:2001203219 修回日期:2001211204作者簡介:劉上峰(19712),男,廣東廣州市人,中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院人類生殖工程研究室博士,從事遺傳病的基因診斷、分子克隆等方面的研究。197 第2期國外醫(yī)學(xué)·生理、病理科學(xué)與臨床分冊
8、第22卷 光染色雖然靈敏度稍低但具有較高的重復(fù)性,且容黑度等參數(shù)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白(也可用內(nèi)標(biāo),即蛋白質(zhì)易完成。組內(nèi)的成員),得到每個蛋白斑點(diǎn)的等電點(diǎn)和相對分3 應(yīng)用子量,這就可建立數(shù)據(jù)庫。隨著需
