綿羊肺源致病性大腸桿菌的分離鑒定及部分生物學(xué)特性的研究.pdf

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1、分類號(hào)：密級：公開學(xué)號(hào)：2015201715單位代碼：10759石河子大學(xué)碩士學(xué)位論文綿羊肺源致病性大腸桿菌的分離鑒定及部分生物學(xué)特性的研究學(xué)位申請人郭強(qiáng)強(qiáng)指導(dǎo)教師周霞教授鐘發(fā)剛研究員申請學(xué)位門類級別農(nóng)學(xué)碩士學(xué)科、專業(yè)名稱預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究方向動(dòng)物傳染病診斷與防治所在學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院中國·新疆·石河子2018年6月Isolation,identificationandpartialbiologicalcharacteristicsofpathogenicEscherichiacolifromsheeplungADissertationSubmittedtoShiheziUn

2、iversityInFulfillmentoftheRequirementsFortheDegreeofMasterofAgricultureByGuoQiang-qiang(PreventiveVeterinaryMedicine)DissertationSupervisor:ZhouXia,ZhongFa-gangShihezi,Xinjiang,ChinaJune,2018項(xiàng)目資助[1]項(xiàng)目名稱：致病性大腸桿菌生物學(xué)特性研究，省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室優(yōu)秀中青年人才培養(yǎng)引導(dǎo)計(jì)劃專項(xiàng)資助（No.SKLGIH2016A02）[2]項(xiàng)目名稱：多胎薩?？?/p>

3、的選育提高及示范推廣，兵團(tuán)重大科技項(xiàng)目計(jì)劃（2017AA006）[3]項(xiàng)目名稱：阿勒泰墾區(qū)現(xiàn)代養(yǎng)殖模式下綿羊高發(fā)疫病綜合防控技術(shù)應(yīng)用于推廣，兵團(tuán)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)與成果轉(zhuǎn)化計(jì)劃項(xiàng)目（2016AC018）全文摘要近年來綿羊呼吸系統(tǒng)疾病日益頻發(fā)，引起該病的病原非常復(fù)雜。腸外致病性大腸桿菌被認(rèn)為是可以特異性的定植于宿主腸外并引發(fā)腸外疾病的主要病因，可以引起新生兒腦膜炎，尿道感染和肺炎等；近年來國內(nèi)外由腸外致病性大腸桿菌感染引起呼吸系統(tǒng)疾病的報(bào)道也越來越多，直接威脅畜牧業(yè)生產(chǎn)和公共衛(wèi)生安全。2016年底新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)石河子地區(qū)周邊團(tuán)場規(guī)模場部分羔羊出現(xiàn)咳嗽、喘氣、口鼻流涎，呼吸

4、和脈搏加快、體溫升高等明顯呼吸道癥狀，最后因呼吸衰竭而亡。為了確定規(guī)模場引起羔羊患呼吸道癥狀的細(xì)菌性病原及其病原特性，本研究以病死羔羊?yàn)檠芯繉ο?，采用?xì)菌常規(guī)分離鑒定結(jié)合16SrRNA序列分析的方法，分離鑒定病原并通過人工感染小鼠和綿羊確定其致病性，同時(shí)分析分離株藥物敏感性、耐藥基因和毒力基因攜帶情況、生物被膜形成能力以及對小鼠肺泡上皮細(xì)胞黏附侵襲能力，為羊源腸外大腸桿菌感染的深入研究提供有用數(shù)據(jù)。1.綿羊肺源致病性大腸桿菌的分離與鑒定：無菌采集不同時(shí)間送檢的因呼吸道感染的發(fā)病羔羊肺臟組織進(jìn)行細(xì)菌的分離培養(yǎng)，經(jīng)生化鑒定和16SrRNA測序分析得到10株大腸桿菌（命名為E

5、xPECXJ-01—XJ-10），結(jié)合小鼠致病性試驗(yàn)和特異性毒力基因檢測確定為腸外致病性大腸桿菌。ExPECXJ-07株引起綿羊肺臟肺泡壁毛細(xì)血管充血，界限不清，支氣管管腔充血，周圍淋巴細(xì)胞浸潤、增生；半數(shù)致死量為109.24CFU/mL，分離株攜帶ibeA、ibeB、ibeC、iutA、fyuA、ireA、hlyD和afa8種毒力因子；菌株都呈現(xiàn)多重耐藥性，對諾氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、復(fù)方新諾明、阿奇霉素、米諾環(huán)素、克林霉素、青霉素、阿莫西林、頭孢唑啉、頭孢拉定、鏈霉素、慶大霉素、多西環(huán)素、麥迪霉素、氟苯尼考等17種抗生素出現(xiàn)不同程度的耐藥，攜帶有str

6、A、strB、aadA1/aadA2、Bla(TEM1)、Bla(OXA1)、TetA和TetB7種耐藥基因。2.綿羊肺源致病性大腸桿菌人工感染試驗(yàn)：為了驗(yàn)證分離于綿羊呼吸道感染大腸桿菌對本動(dòng)物的致病性，本試驗(yàn)選擇綿羊肺源致病性大腸桿菌XJ-07株通過滴鼻感染，滴鼻加氣管注射，靜脈注射，口服和肌肉注射方式人工感染7只2月齡左右健康寒羊羔羊，觀察感染羔羊臨床癥狀，定期進(jìn)行血常規(guī)分析，觀察動(dòng)物主要臟器病理變化，同時(shí)分離細(xì)菌。試驗(yàn)結(jié)果顯示，最佳感染方式為口服（2×1010CFU/mL）和肌肉注射（2×109CFU/mL），這兩組羔羊在感染后9h開始出現(xiàn)輕微腹瀉癥狀，隨著時(shí)間延

7、長腹瀉逐漸消失，感染后16h出現(xiàn)了以呼吸道感染癥狀為主要特征病癥，表現(xiàn)為咳嗽、喘氣、呼吸增速以及鼻腔流出大量分泌物、精神沉郁等；感染羊血液中白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)目和體溫較對照組綿羊偏高；綿羊肺臟表現(xiàn)不同程度的出血和肝變，脾臟和腦有出血現(xiàn)象。病理學(xué)觀察到試驗(yàn)組綿羊心肌纖維斷裂，肺臟支氣管管腔上皮細(xì)胞脫落，炎性細(xì)胞浸潤，從剖檢羊肝臟、肺臟、脾臟、腦和心臟都分離到和感染時(shí)一致的細(xì)菌。采用消化道和肌肉注射方式人工感染綿羊成功復(fù)制了ExPEC在羔羊上的發(fā)病。3.綿羊肺源致病性大腸桿菌生物被膜形成能力研究：采用96孔微量板法和試管法定性和定量分析