核仁素在血管新生中的作用及其機(jī)制初步探討

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1、中圖分類號＆三魚三UDC61O碩士學(xué)位論文學(xué)校代碼!Q三三三密級公玨核仁素在血管新生中的作用及其機(jī)制初步探討TheRoleofNucleolininAngiogenesisandItsUnderlyingMechanisms作者姓名：學(xué)科專業(yè)：研究方向：學(xué)院(系、所)：指導(dǎo)教師：昌IJ指導(dǎo)教師：陳岸蘭病理學(xué)與病理生理學(xué)心血管病理生理基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院肖獻(xiàn)忠教授王慷慨副教授論文答辯日期堡!三：三：!答辯委員會主中南大學(xué)2013年5月原創(chuàng)性聲明本人聲明，所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得

2、的研究成果。盡我所知，除了論文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得中南大學(xué)或其他單位的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我共同工作的同志對本研究所作的貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明。作者簽名：：強(qiáng)崖蘭日期：墊縫年魚月絲日學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本人了解中南大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：學(xué)校有權(quán)保留學(xué)位論文并根據(jù)國家或湖南省有關(guān)部門規(guī)定送交學(xué)位論文，允許學(xué)位論文被查閱和借閱；學(xué)校可以公布學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容，可以采用復(fù)印、縮印或其它手段保存

3、學(xué)位論文。同時(shí)授權(quán)中國科學(xué)技術(shù)信息研究所將本學(xué)位論文收錄到《中國學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫》，并通過網(wǎng)絡(luò)向社會公眾提供信息服務(wù)。本課題受以下基金資助：1．國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81270201)：細(xì)胞內(nèi)核仁素對VEGF介導(dǎo)的血管生成的影響及機(jī)制研究?；鹬鞒秩恕蹩犊苯淌?。2．湖南省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(11JJ2047)：核仁素在缺血預(yù)適應(yīng)保護(hù)中的作用及其機(jī)制研究。基金主持人——王慷慨副教授。核仁素在血管新生中的作用及其機(jī)制初步探討摘要：血管新生是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過程，但其具體機(jī)制目前尚未完全

4、明了。核仁素是一種具有多種生物學(xué)功能，在真核生物中高度保守的核仁磷酸蛋白，也是一種重要的RNA結(jié)合蛋白，具有在核仁、胞核、胞漿，甚至細(xì)胞膜表面穿梭的特性。大量研究表明，細(xì)胞膜表面核仁素參與血管新生的調(diào)節(jié)。然而，核仁素的RNA結(jié)合特性在血管新生中有何作用，目前仍不清楚。本研究在明確核仁素對血管新生起調(diào)節(jié)作用后，擬初步探討其RNA結(jié)合特性在血管新生中的作用及其可能的機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)首先通過建立小鼠心肌缺血模型，利用免疫組化和免疫熒光技術(shù)觀察血管新生和核仁素的表達(dá)，并采用PCR和WesternBlot技術(shù)

5、檢測血管新生相關(guān)基因和核仁素的表達(dá)。其次，在細(xì)胞水平，建立VEGF誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(rajvzc)發(fā)生細(xì)胞遷移和管型形成的模型，采用增加和降低核仁素表達(dá)的研究手段，探討核仁素在VEGF誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷移和管型形成中的作用；同時(shí)利用PCR和WesternBlot技術(shù)觀察血管新生相關(guān)基因的表達(dá)情況。最后利用蛋白質(zhì)．RNA免疫共沉淀技術(shù)探討血管新生中核仁素可能調(diào)控的相關(guān)靶基因，以闡明核仁素在血管新生中發(fā)揮作用的可能機(jī)制。主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：1．整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。(1)免疫組化和免疫熒光分析發(fā)現(xiàn)：心肌缺血后

6、15天，缺血組心肌組織中核仁素和血管內(nèi)皮鈣粘蛋白表達(dá)升高，與假手術(shù)組比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(2)PCR和WesternBlot技術(shù)檢測顯示：缺血組心肌組織中核仁素和血管新生相關(guān)基因表達(dá)升高，與假手術(shù)組比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(3)HE染色顯示核仁素轉(zhuǎn)基因小鼠血管密度明顯增高，免疫組化、PCR和WestemBlot技術(shù)檢測顯示血管新生相關(guān)基因表達(dá)升高，與野生型小鼠相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2．細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。(1)PCR和WestemBlot技術(shù)檢測顯示VEGF可誘導(dǎo)HUVEC核仁素表達(dá)升高，并在一定程度

7、上呈時(shí)間和濃度依賴性。III(2)核仁素過表達(dá)能促進(jìn)VEGF誘導(dǎo)的HUVEC發(fā)生細(xì)胞遷移和管型形成；反之，siRNA介導(dǎo)的核仁素低表達(dá)則能抑制VEGF誘導(dǎo)的HUVEC發(fā)生細(xì)胞遷移和管型形成。(3)生物信息學(xué)分析顯示多個(gè)血管新生相關(guān)基因如VE．cadherin，Tie．2，MMP9，Endoglin，COX43等的mRNA含有一個(gè)或多個(gè)核仁素的結(jié)合元件。(4)PCR和WesternBlot技術(shù)檢測顯示siRNA介導(dǎo)的核仁素低表達(dá)能抑制血管新生相關(guān)基因的表達(dá)。(5)利用蛋白質(zhì)．RNA免疫沉淀技術(shù)，發(fā)

8、現(xiàn)核仁素與血管新生相關(guān)基因MMP9，Endoglin，integrinQV有相互作用。本實(shí)驗(yàn)可得出如下結(jié)論：1．C23能促進(jìn)血管新生。2．C23的RNA結(jié)合特性可能參與了VEGF介導(dǎo)的血管新生。圖21幅，表2個(gè)，參考文獻(xiàn)46篇。關(guān)鍵詞：核仁素；血管新生：血管內(nèi)皮生長因子；管型形成；內(nèi)皮細(xì)胞鈣粘蛋白分類號：R363IVTheRoleofNucleolininAngiogenesisandItsUnderlyingMechanismsAbstract：Angiogenesisisacomplexbi