磷脂轉(zhuǎn)運蛋白低表達對巨噬細胞炎癥因子的表達的影響及分子機制

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圓碩士學位論文IIIIIIIIMIIUIIIWF2809090論文題目：磷脂轉(zhuǎn)運蛋白低表達對巨噬細胞炎癥因子的表達的影響及分子機制作者姓名：劉帥學科、專業(yè)：病理學與病理生理學學位類型：科學學位研究方向：脂質(zhì)代謝與動脈粥樣硬化指導教師：秦樹存教授入學時間：2010年9月論文工作起止時間：2011年7月～2013年2月 目錄中文摘要???????????????????????????????????1英文摘要??????????????????????????????????·5符號說明??·—1上．—jL-刖舌????????????材料與方法????????????????????????????????··14結(jié)果???????????????????????????????“??????????··40討論?????????????????????????????????????????????·42結(jié)論?????????????????????????????????????????????·45附表?????????????????????????????????????????????·46參考文獻???????????????????????????????????·53綜j苤???????????????”?????????????????????????????··57致謝?????????????????????????????????????????????·69原創(chuàng)性聲明?????????????“ ＼㈣嬲磷脂轉(zhuǎn)運蛋白低表達對巨噬細胞炎癥因子表達的影響及分子機制研究生：劉帥專業(yè)：病理學與病理生理學導師：秦樹存教授中文摘要目的炎癥(inflammation)在人類多種重要疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中起著關(guān)鍵的作用。巨噬細胞(macrophage)作為一種免疫細胞，在炎癥的多個環(huán)節(jié)起到重要作用。核轉(zhuǎn)錄因子r．B(nucleusfactorkappa-B，NFrB)是巨噬細胞參與的炎癥信號通路中最重要的轉(zhuǎn)錄因子之一，它的激活能引起多種炎癥因子如白細胞介素(interleukin)、腫瘤壞死因子a(tumornecrosisfactorQ，TNF一伐)等表達升高。磷脂轉(zhuǎn)運蛋圭t(phospholipidtransferprotein，PLTP)參與炎癥發(fā)生發(fā)展過程，PLTP能結(jié)合、轉(zhuǎn)運以及中和脂多糖(1ip．polysaccharide，LPS)，PLTP缺乏dx鼠(PLTP-／一)在致死劑量的內(nèi)毒素血癥時血漿炎癥因子表達升高，器官損傷加重，死亡率增加。該過程中高表達的炎癥因子均受NFr．B調(diào)控，且在巨噬細胞內(nèi)均有表達，提示上述炎癥因子表達升高很可能與巨噬細胞NFr．．B激活相關(guān)。本研究擬采用多種巨噬細胞為模型，探討PLTP低表達或不表達對LPS刺激的影響及可能的分子機制。方法1、小鼠繁育，PLTP敲除雜合子為親代，繁育出子代經(jīng)基因型鑒定得到純合子PLTP．／．及同窩出生野生型小(wildtypemic，WT)。從中選取雄性WT和PLTP-／．各8只。2i小鼠第八周齡時，提取LPS誘導的腹腔巨噬細胞，分離骨髓進行原代培養(yǎng)，并添加含集落刺激因子的Lcell培養(yǎng)基進行誘導。培養(yǎng)十天左右，骨髓源性巨噬細胞(bonemalTOWderivedmacrophage，BMDM)誘導完成。3、培養(yǎng)巨噬細胞模型RAW264．7、人臍靜脈上皮細胞(Humanumbilicalveinepithelialcell，HUVEC)，分為三組分別為空白組(標記為blank)、對照組(標記為ControlsiRNA)和實驗組(標記為PLTPsiRNA)。 4、將WT和PLTP．／．BMDM兩種細胞分別在不同的時間段(分別為0．5h，lh，2h)給予LPS(濃度為200ng／m1)刺激。5、將PLTPsiRNARAW264．7在不同的時間段(分別為O．5h，lh，2h)給予LPS(濃度為200ng／m1)刺激。6、將PLTPsiRNAHUVEC在不同的時間段(分別為O．5h，lh，2h)給予TNF-0【(濃度為20ng／m1)刺激。7、WesternBlot檢測與NFr．B信號通路相關(guān)蛋白；NFr．_B活性亞單位p65、胞漿內(nèi)抑制亞單位Iv／3．a(chǎn)、信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄激活因子3(Signaltransducersandactivatorsoftranscription3，STAT3)及其磷酸化蛋f蘭t(pSTAT3)、轉(zhuǎn)錄生長因子激酶1(transformgrowthfactoractivatedkinase1，TAKl)及其磷酸化蛋白(pTAKI)，核蛋白內(nèi)參H3以及胞漿蛋白內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH)。8、實時熒光定量PCR(Real．Time．PCR)技術(shù)檢測細胞中相關(guān)炎癥因子IL．6、IL一10、TNF．a(chǎn)和干擾素．7(interferon．Y，IFN一7)mRNA的表達。9、酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme．1inkedimmunosorbentassay)檢測BNDM培養(yǎng)基中IL．6、IL．10、TNF．a(chǎn)和IFN．Y‘含量。10、免疫熒光染色技術(shù)檢測核蛋白‘p65轉(zhuǎn)位。結(jié)果1、LPS刺激下腹腔巨噬細胞及原代巨噬細胞炎癥因子表達的實驗結(jié)果；(1)PLTP-／．腹腔巨噬細胞炎癥因子IL．10、IFN吖、TNF．Q和IL．6的mRNA的表達均較WT顯著升高(尸O．05)。(3)PLTP．／．BMDM培養(yǎng)基中炎癥因子表達較WT均有所升高：IL．10和TNF—c【升高198．5％(P0．05)。2、LPS刺激下WT和PLTP．／．BMDM及LPS刺激下PLTPkonckdownRAW264．7p65和Ir．_B—a結(jié)果；(1)BMDM核內(nèi)p65含量，PLTP一／一較WT增加30．5％(P<0．05)。(2)BMDM胞漿內(nèi)Ir．B—a含量，PLTP．／．較WT減少34％(P<0．05)。2 (3)RAW264．7核內(nèi)p65含量，PLTPsiRNA組較controlsiRNA組增加200％(P<0．05)。(4)RAW264．7胞漿內(nèi)Ir．B—Gt含量，PLTPsiRNA組較controlsiRNA組減少43％(P<0．02)。3、TNF．Q誘導的HUVECp65和Ir．B．0【結(jié)果(1)HUVEC核內(nèi)p65含量，PLTPsiRNA組較ControlsiRNA組增加54％(P<0．05)。(2)HUVEC胞漿內(nèi)Ir．_B．a(chǎn)含量，PLTPsiRNA組較ControlsiRNA組減少351．2％P0．05)，nostatisticalsignificance．(3)PLTP-／-BMDMinflammatoryfactorsarehigherthanWT：IL-10andTNF·qarehigherthanWTby198．5％(尸0．05)，nostatistical6 significance．2PLTPdeficiencyenhancednucleartranslocationofNFKBinBMDMandLPSinducedNFKBactivationwasenhancedinPLTPknockdownRAW264．7(1)ThecontentofBMDMnuclearp65，PLTP-／一VSWTincreases30．5％(尸2．0說明提取的RNA有降解。(12)根據(jù)所側(cè)得的RNA濃度，將每個樣本的RNA均使用DEPC水稀釋成相同濃度，以便用于今后的實驗。2．2．2QuantcDNA第一鏈合成試劑盒合成eDNA注意事項；用于cDNA合成反應的溶液試劑盡可能的用DEPC處理，并在高壓滅菌后使用，有些試劑不能進行高壓滅菌時，首先用經(jīng)過高壓滅菌的器具、水等配置溶液后，再將溶液進行過濾除菌處理；RNA樣品要避免基因組DNA污染；避免反復凍融RNA；試劑盒的各組成分應在．20"(2保存；cDNA產(chǎn)物應在．20℃保存。(1)將模板RNA在冰上解凍，引物、10xRTmix(其中包含RNasin和DTT)、超純dNTP混合液、RNase—freeddH20在室溫(15—25℃)解凍，解凍后迅速置于冰上，使用前將每種溶液渦旋振蕩混勻，簡短離心以收集殘留管壁上的液體。(2)取29L總RNA用于反應體系，若反應體系為20pL，則加入RNA模板的體積不能超過13pL。(3)按照以下體系混合；成分10×RTmixdNTP混合液Random體積21xL29L 反轉(zhuǎn)錄酶1HL模板RNAXlxL加RNAase．free水至總體積為20I_tL(4)按以上反應體系配制混合液，徹底混勻，渦旋振蕩時間不超過5秒種，簡短離心并置于冰上(如下游進行熒光定量PCR實驗，使用10I．tL逆轉(zhuǎn)錄反應體系)。(5)37。C孵育60min。(6)將逆轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物進行后續(xù)PCR反應和熒光定量PCR反應。2．2．3實時熒光定量PCR2．2．3．1實時熒光定量PCR反應原理實時熒光定量PCR是目前應用非常廣泛的一種實驗技術(shù)，在PCR反應體系中加入熒光集團，實時熒光定量PCR儀能夠利用對熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最終通過標準曲線對未知模板精確定量分析或不同模板間的相對量的比較的方法。在熒光定量PCR技術(shù)中，有一個十分重要的概念就是Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值代表每個反應管體系內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定的熒光域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。它的大小取決于目的模板的數(shù)量，每個模板的Ct值與該模板的其實數(shù)目的對數(shù)存在線性關(guān)系，其實越多，Ct值越小，也就是Ct值越小，起始模板數(shù)量就越多。．該試劑盒使用的是SYBR熒光染料，在PCR反應體系中，加入SYBY熒光染料，SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，才能發(fā)射熒光信號，而不摻入DNA鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加相對應。2．2．3．2引物濃度將引物溶于DEPC水，使其濃度為2I．tmol／L，以使其在后續(xù)的實時熒光定量反應體系里引物濃度為200I．tmol／L，能夠與試劑盒的要求向符合。2．2．3．3PCR反應(1)反應體系成分10斗L2．5XRealMASterMix／SYBRsolution4．5pL26 上游引物下游引物模板去離子水(2)反應條件1lxL1lxL1“L2．51xL①95℃，預變性5min；②95℃，變性30秒：③68℃，退火20秒；④72℃，延伸20秒：⑤步驟2—4重復40．45個循環(huán)；(3)結(jié)果計算各組目的基因與內(nèi)參基因的Ct值由計算機自動生成，計算各組目的基因與內(nèi)參基因的差值△Ct值，再計算出實驗PK組與對照WT組ACt值的差，即為aACt值，求其2的．AACt次方，即為實驗PK組目的基因相對于對照WT組目的基因的量的比值，然后用相應的作圖軟件做成柱形圖即可。、2．3蛋白免疫印跡技術(shù)(Westernblot)檢測蛋白質(zhì)含量2．3．1蛋白提取(1)按照實驗所用試劑盒說明書配制工作液；即RIPA／1ml加入10Mlpmsf。(2)用PBS將細胞洗1．2遍，盡量用槍將PBS吸干凈，以免影響裂解液的作用。(3)按照六孔板每孔細胞量加入150．2501aL裂解液，培養(yǎng)瓶(瓶底面積250cm2)加入500．75011L裂解液的標準加入裂解液裂。(4)將六孔板或培養(yǎng)瓶置于冰上，用槍反復吹打數(shù)下，使裂解液與細胞充分接觸，肉眼觀察裂解液變渾濁或鏡下觀察細胞都滑落下來時停止吹打，轉(zhuǎn)移至1．5ml離心管中冰浴至少30rain。(5)4。C，12000rpm離心30min。(6)取上清至新的1．5mlEP管中，4"C暫時保存，如需放置較長時間應保存．20℃。2．3．2BCA法蛋白濃度測定(1)配制BCA工作液：根據(jù)標準品和樣品的數(shù)量，按照BCA試劑與Cu27 試劑體積比為50：1的比例配制工作液，是他們兩個充分混勻(開始肯呢個會有渾濁現(xiàn)象，但充分混勻后渾濁就會消失)，已配好的工作液室溫可以放置24小時。(2)稀釋標準品：取10斗L標準品BSA用試劑盒中的PBS稀釋l0倍，終體積為100“L，BSA終濃度為O．5mg／ml。將稀釋后的標準品按0、21．tL、41xL、61．tL‘,81aL、121,tL、161,tL、209L加到96孔板中，再依次向上述孔中加入209L、181．tL、16“L、141,tL、129L、81．tL、4p,L、01．tL的PBS補足至體積為20pL。(3)重復第二步，再做一條標準曲線。(4)稀釋樣品：根據(jù)以往的經(jīng)驗或參考文獻，將提取的蛋白稀釋一定的倍數(shù)(如4倍、8倍、16倍等)。由于吸取的量比較小，為了最大限度的減少誤差，先加樣品再加稀釋液PBS，不要用槍吹打。標準曲線前面的點可能不是很準確，所以極可能的讓樣品點落在標準曲線后1／2部分。(5)想每個孔中加入2001,tLBCA工作液，37"C孵育25—30min(以標準曲線和樣品的顏色變化為依據(jù)定時間的長短)。(6)若使用溫箱孵育為放置液體蒸發(fā)造成測量誤差，要用密封膜將實驗所用孔密封起來。2．3．3蛋白樣品處理(1)調(diào)濃度：首先，用酶標儀側(cè)得蛋白在562nm波長下標準品和樣品的數(shù)值，通過標準曲線計算出蛋白的實際濃度，將蛋白濃度調(diào)整一致，并保證在后續(xù)的電泳上樣中每孔的最大上樣量小于等于20pL，蛋白量在l5—30mg。(2)蛋白變性：將調(diào)整好濃度的蛋白樣品和4×蛋白上樣緩沖液按照體積比3：l的比例混合均勻，煮沸變性5．10min。(3)冷卻后．20"C短暫保存或．70℃長期保存。2．3．4注意事項(1)在加入裂解液前一定要加入PMSF(RIPA：PFSF=10：1)，也可以加入PI(蛋白酶抑制劑，終濃度100lxmol／L)。(2)提蛋白的整個過程一定要在冰上進行，以防止蛋白的降解。(3)在加入RIPA的混合液時要根據(jù)細胞的數(shù)量而定，以免造成蛋白濃度過低。(4)不同的玻璃板所容納的樣品的體積不同，為了上樣時樣品溢出，28 一般上樣量在25ul以下。(5)因蛋白酶抑制劑具有毒性，在整個操作的過程中要帶手套和口罩。(6)蛋白煮沸變性時EP管蓋子有可能壓力過大被打開，所以在向EP管中加樣品時良不要過多，最多不要超過lml。2．3．5Westernblot實驗相關(guān)試劑的配置(1)10％過硫酸胺(AP)：用微量電子稱稱取AP0．19，用去離子水溶解后，4"C保存?zhèn)溆?，最大期限為一周?2)電泳緩沖液：Tris—base39，甘氨酸14．49，SDSlg，加去離子水至1L，磁力棒攪拌器助溶后，室溫保存，電泳緩沖液可以重復使用2．3次(注意；SDS分子量小，量輕易擴散，稱取時一定要戴手套和口罩)。(3)電轉(zhuǎn)緩沖液：甘氨酸14．49，Tris．base3．99，去離子水800ml溶解后再加入甲醇200ml，至終體積1L，溶解后4"C避光保存(切記不要在甘氨酸和Tris．base未溶解前加入甲醇，會造成這兩種物質(zhì)難以溶解)。(4)TBST溶液；把購買的20xTBS稀釋成為1×后，每500ml加入Tween一200．5ml。(5)封閉液：用1xTBST配制10％的脫脂奶粉，用于封閉抗原。(6)分離膠的配制(單位：“L)：試劑8％(5m1)10％(5m1)12％(5m1)去離子水2375202517004×分離膠緩沖液125030％丙烯酰胺混合液132516752000lO％過硫酸胺‘50TEMED4(7)濃縮膠的配制(單位：“L)；試劑5ml10ml去離子水114722944×分離膠緩沖液500100030％丙烯酰胺混合液333666 10％過硫酸胺TEMED2024042．3．6電泳2．3．6．1灌膠(1)將1．0mm厚的帶下兩個玻璃板對齊后放入玻璃夾中加緊(小玻璃板在內(nèi)，大玻璃板在外)，垂直向下卡在架子上，兩玻璃板的低端對齊，防止漏膠。(2)根據(jù)所用膠的濃度按上面的配方配分離膠，TEMED為促凝劑，所以要在最后加，加上快速混勻后立即灌膠。(3)然后用蒸餾水封膠(用槍加水時一定要緩慢，否則會造成分離膠的液面不平，影響電泳)，待分離膠充分凝固后(約30min)將水倒掉，用吸水紙吸干凈水。(4)根據(jù)所用膠的濃度按上面的配方配濃縮膠，快速混勻后立刻灌膠，插上梳子(注意一定要將梳子垂直慢慢的插入玻璃板內(nèi)，不要產(chǎn)生氣泡)，約30min凝固。2．3．6．2上樣電泳(1)將玻璃夾放入電泳槽，拔掉梳子(一定要雙手均勻用力垂直向上慢慢拔，否則會最壞濃縮膠)。(2)上樣：Marker3p,L，樣品每孔201xL(要用109L的槍加樣)。(3)電泳：蓋好蓋子(注意電極千萬不能反了?紅對紅，黑對黑)，設(shè)置為恒壓80V，電泳約20．30min，待樣本跑完積層膠后，將電壓調(diào)至160V，繼續(xù)電泳(電泳時間以溴酚蘭跑到分離膠的底端為止)。2．3．6．3轉(zhuǎn)膜(1)準備物品：提前30min4。C預冷1×電轉(zhuǎn)液、海綿墊和濾紙各兩張(均用電轉(zhuǎn)液浸泡)、PVDF膜、玻璃棒、玻璃皿、甲醇、剪刀、尺子等。(2)將玻璃板打開，使大小玻璃板分開，切去多余的分離膠和濃縮膠。對照Marker將目的膠切下，做好標記放到盛有電轉(zhuǎn)液的玻璃皿中，防止干燥。(3)用直尺大體測量目的膠的長和寬，剪取與之大小相等的PVDF膜，在甲醇中浸泡約5秒中活化，接著放到電轉(zhuǎn)液中浸泡10．15min。(4)將電轉(zhuǎn)用夾子打開，黑色的一面在下，依次在上面放上海綿墊、濾紙、30 凝膠、PVDF膜(在濾紙的腳上左上標記，與膠接觸的一面為正面)、濾紙、海綿墊各一張。沒放一樣都要用玻璃棒搟一下氣泡，夾住夾子放到電轉(zhuǎn)槽中，黑色的一面對電轉(zhuǎn)槽黑色一面，白色的一面對電轉(zhuǎn)槽紅色的一面，在電泳槽的兩側(cè)放上冰袋，倒上預冷的電轉(zhuǎn)液，蓋上帶有電極的蓋子。將電轉(zhuǎn)槽放到盛有碎冰的水盆或泡沫盒中，連接電源，打開電轉(zhuǎn)儀，設(shè)置轉(zhuǎn)膜條件(電壓為恒壓100V，時間要根據(jù)蛋白分子量餓大小而定，～般參考文獻或做預實驗摸索條件1。’(5)轉(zhuǎn)膜完成后，將膠和PVDF膜取出(查看膠上是否還有顏色，如有說明轉(zhuǎn)膜時間不夠，下一次要增加轉(zhuǎn)膜時間)，將PVDF膜與膠接觸的一面朝上放到麗春紅染液中染色5．10分鐘，用蒸餾水或脫色液沖洗PVDF膜數(shù)遍直到PVDF膜無染色液，觀察蛋白轉(zhuǎn)膜情況。2．3．6．4封閉將PVDF膜正面朝上(即蛋白面朝上)放入到約30ml，濃度為10％的封閉液中，置于水平搖床上室溫搖晃2．3小時。2．3．6．5一抗孵育根據(jù)膜的大小，選擇適合的自封袋，加入事先配好的3ml左右的封閉液，按照一定的稀釋倍數(shù)稀釋一抗，混勻，將PVDF膜放到自封袋中置于搖床上，室溫搖晃3．5小時或4。C搖晃過夜。為防止一抗變性可加入適量10％的疊氮鈉2／．tL，4。C保存，可重復使用3．4次。2．3．6．6二抗孵育(1)洗膜：將PVDF膜從一抗中拿出放到小飯盒中，用TBST洗4次，前三次個5min，第四次15min。(2)用同樣的方法稀釋二抗，將PVDF膜放到二抗中，室溫搖床搖晃1．2h。(3)洗膜：步驟同第一步。2．3．6．7ECL顯影(1)準備：移液器、剪刀、鑷子、槍頭、曝光夾、手套、膠片、ECL液、飯盒、大平皿、廢液缸等。(2)配ECL液：根據(jù)所需ECL液的量，將A、B液等體積混合(注意：在吸完A液后切記要換槍頭，否則會交叉污染，使試劑失效)，混勻。(3)將所有物品拿到暗室(手機等發(fā)光物體最好不要帶到暗室，以免造成31 膠片曝光)，按照PVDF膜的大小和要壓片子的數(shù)量剪膠片，同樣在膠片上做好標記。(4)將PVDF膜正面朝上放到曝光夾上，滴上ECL顯色液，將塑料膜蓋上壓平，把膠片放到PVDF膜上，合上夾子曝光，室溫數(shù)秒即可(有時也要根據(jù)PVDF膜上蛋白量的多少而定，可重復壓幾次找，找到合適的時間)。(5)曝光完畢后，迅速將膠片放到顯影液中，隨時觀察條帶出現(xiàn)的亮度，待調(diào)到出清楚來后立即放到定影液中(約5．8分鐘)，最后用自來水沖洗干凈后晾干。(6)將顯影后的底片掃描后分析數(shù)據(jù)。2．4ELISA檢測血漿IL．6、IL．10、IFN．7和TNF．a(chǎn)水平2．4．1檢測培養(yǎng)基中IL．6水平2．4．1．1實驗準備(1)儀器設(shè)備：酶標儀、1009L和1000ItL加樣器、200多通道加樣器、加樣槽等。(2)計算：孔數(shù)=(標準曲線(8×2)+樣本數(shù)x2+對照x2)x重復次數(shù)每種試劑總量=孔數(shù)x每孔液體量(3)制冰以放置樣本：將試劑盒置于室溫以平衡試劑溫度(加樣前打開酶標板包裝以減少水汽凝結(jié))。(4)IL．6對照配制：用lml去離子水或蒸餾水溶解對照樣品，充分溶解。(5)洗滌液配制：如果使用前濃縮液出現(xiàn)晶體，拿到室溫輕輕混勻直到晶體溶解，要準備充分的洗液。去25ml濃縮液加入到600ml去離子水或蒸餾水中配制成洗滌工作液。(6)酶反應液：在使用前15min內(nèi)將顯色劑A和B等體積均勻混合均勻后使用。每孔加入1001．tL。(7)巨噬細胞IL．6標準品的配制：用5ml的標準稀釋液RD5T(不能用自己配制或其它稀釋液)稀釋溶解IL．6標準品，，稀釋后標準品的濃度為500pg／ml。在做梯度稀釋之前至少輕輕攪拌5min，以確保標準品完全均勻稀釋。(8)取2001．tL儲存液用校準稀釋液RD5T一次做一個2倍的稀釋，使其濃度依次為250pg／ml、125pg／ml、62．5pg／ml、31．2pg／ml、15．6pg／ml、7．8pg／ml。32 其中最高濃度為儲存液濃度500pg／ml，用校準稀釋液RD5T作為最低濃度0pg／ml。2．4．1．2操作步驟(1)在使用前，將所有試劑和樣本保持室溫。(2)計算一下，取下所用酶標板孔，其余酶標板放回鋁箔袋子里。(3)向酶標板的每個孔內(nèi)50ttLRDl．14稀釋液。(4)向加入RDl．14稀釋液的孔內(nèi)加入501．tL標準品、樣品和對照，用粘性的封口膜封住每個孔，輕敲1min使其均勻，室溫下孵育2h。(5)洗板：將孔內(nèi)原有的液體倒出(剩下的液體用吸水紙吸干凈，尤其是最后一步洗板，最為關(guān)鍵)往每個孔里加400pL的洗滌液，用手指輕輕敲擊酶標板的側(cè)壁lmin，使其充分洗滌，重復洗滌5次。(6)向每個孔內(nèi)加入1009L酶標記抗體，用封口膜封1：3，室溫孵育2h。(7)洗板：重復第五步。(8)向每個孔內(nèi)加1001．tL酶作用底物，輕敲混勻，室溫避光孵育30min。(9)向每孔中加入1009L終止液，輕敲混勻，以終止反應。(10)用酶標儀450nm波長側(cè)其吸光度，用540nm或570nm波長矯正。(11)計算；根據(jù)吸光度的值，計算巨噬細胞培養(yǎng)基中IL．6的濃度。2．4．1．3注意事項(1)實驗前一定要將試劑盒提前30min放于室溫，否則影響監(jiān)測結(jié)果。(2)酶作用底物一定要避光，顏色變化為無色一藍色_黃色。(3)終止液穿透力很強，千萬不要弄到皮膚上。(4)整個實驗過程中要勤換手套，避免交叉污染。2．4．2檢測培養(yǎng)基中IL．10水平2．4．2．1實驗準備(1)儀器設(shè)備：酶標儀、1009L和10009L加樣器、200多通道加樣器、加樣槽等。(2)計算：孔數(shù)=(標準曲線(8x2)+樣本數(shù)x2+對照x2)x重復次數(shù)每種試劑總量=孔數(shù)×每孔液體量(3)制冰以放置樣本：將試劑盒置于室溫以平衡試劑溫度(加樣前打開酶標板包裝以減少水汽凝結(jié))。33 (4)IL．10對照配制：用lml去離子水或蒸餾水溶解對照樣品，充分溶解。(5)洗滌液配制：如果使用前濃縮液出現(xiàn)晶體，拿到室溫輕輕混勻直到晶體完全溶解，要準備充分的洗液。取25ml濃縮液加入到600ml去離子水或蒸餾水中配制成洗滌工作液。(6)酶反應液：在使用前15min內(nèi)將顯色劑A和B等體積均勻混合均勻后使用。每孑L加入100rLL(注意混合好的液體一定要避光存放)。(7)巨噬細胞IL一10標準品的配制：用5ml的標準稀釋液RD5T(不能用自己配制或其它稀釋液)稀釋溶解IL．10標準品，，稀釋后標準品的濃度為1000pg／ml。在做梯度稀釋之前要至少輕輕攪拌5min，以確保標準品完全均勻稀釋。(8)取2009L儲存液用校準稀釋液RD5T一次做一個2倍的稀釋，使其濃度依次為500pg／ml、250pg／ml、125pg／ml、62．5pg／ml、31．2pg／ml、15．6pg／ml。其中最高濃度為儲存液濃度1000pg／ml，用校準稀釋液作為最低濃度0pg／ml。2．4．2．2操作步驟(1)在使用前，將所有試劑和樣本保持室溫。(2)計算一下，取下所用酶標板孔，其余酶標板放回鋁箔袋子里。(3)向酶標板的每個孔內(nèi)501．tLRDl—14稀釋液。即使在用之前和用的過程中RDl．14可能會有未溶解的物質(zhì)。(4)向加入RDl．14稀釋液的孔內(nèi)加入509L標準品、樣品和對照，用粘性的封口膜封住每個孔，輕敲1rain使其均勻，室溫下孵育2h。(5)洗板：將孑L內(nèi)原有的液體吸出(剩下的液體用吸水紙吸干凈，尤其是最后一步洗板，最為關(guān)鍵)往每個孔里加4001,tL的洗滌液，用手指輕輕敲擊酶標板的側(cè)壁lmin，使其充分洗滌，重復洗滌5次。(6)向每個孔內(nèi)加入100NL酶標記抗體，用封口膜封口，室溫孵育2h。(7)洗板：重復第五步。(8)向每個孔內(nèi)加1009L酶作用底物，輕敲混勻，室溫避光孵育30min。(9)向每孔中加入1001．tL終止液，輕敲混勻，以終止反應。(10)用酶標儀450nm波長側(cè)其吸光度，用540nm或570nm波長矯正。2．4．2．3注意事項．34 (1)實驗前一定要將試劑盒提前30min放于室溫，否則影響監(jiān)測結(jié)果。(2)酶作用底物一定要避光，顏色變化為無色一藍色_黃色。(3)終止液穿透力很強，千萬不要弄到皮膚上?！?4)整個實驗過程中要勤換手套，避免交叉污染。2．4．3檢測培養(yǎng)基中IFN-丫水平2．4．3．1實驗準備(1)儀器設(shè)備：酶標儀、100}tL和10009L加樣器、200多通道加樣器、加樣槽等。(2)計算：孔數(shù)=(標準曲線(8×2)+樣本數(shù)x2+對照x2)x重復次數(shù)每種試劑總量=孔數(shù)×每孔液體量(3)制冰以放置樣本及試劑：將試劑盒置于室溫以平衡試劑溫度(加樣前打開酶標板包裝以減少水汽凝結(jié))。(4)IFN．^，對照配制：用lml去離子水或蒸餾水溶解對照樣品，充分溶解。(5)洗滌液配制：如果使用前濃縮液出現(xiàn)晶體，拿到室溫輕輕混勻直到晶體溶解，要準備充分的洗液。去25ml濃縮液加入到600ml去離子水或蒸餾水中配制成洗滌工作液。(6)酶反應液：在使用前15min內(nèi)將顯色劑A和B等體積均勻混合均勻后使用。每孔加入100I．tL。(7)巨噬細胞IFN．丫標準品的配制：用2ml的RD5Y稀釋液溶解IFN一丫標準品(不能用其他的稀釋劑代替)，溶解后的IFN一丫標準品的濃度為3000pg／ml，溶解后的標準品至少要放置5min才能進行后續(xù)的稀釋。(8)拿8個新的15ml離心管，取400I-tL的RD5Y稀釋液到第一個15ml離心管中，其余的加入200I．tL的RD5Y稀釋液，向第一離心管中加入1009L的IFN．丫標準品，此時標準品的濃度為600pg／ml。充分混勻后取2001xL加入到第二個離心管中，以此類推，加到第七個離心管。此時從第一管到第八管的濃度分別為：600pg／ml、300pg／ml、150pg／ml、75pg／ml、37．5pg／ml、18．8pg／ml、9．4pg／ml、0pg／ml。2．4．3．2操作步驟(1)在使用前，將所有試劑和樣本保持室溫。(2)計算一下，取下所用酶標板孔，其余酶標板放回鋁箔袋子里。35 (3)向酶標板的每個孔內(nèi)50pLRDl—21到每一個孔。(4)向加入RDl—21的孔內(nèi)加入50l_tL標準品、樣品和對照，用粘性的封口膜封住每個孔，輕敲1min使其均勻，室溫下孵育2h。做好標記，以區(qū)別樣品、對照和標準品。(5)將孔內(nèi)原有的液體倒出(剩下的液體用吸水紙吸干凈，尤其是最后一步洗板，最為關(guān)鍵)往每個孔里加400I-tL的洗滌液，用手指輕輕敲擊酶標板的側(cè)壁lmin，使其充分洗滌，重復洗滌5次。(6)向每個孔內(nèi)加入1001．tL酶標記抗體，用封El膜封口，室溫孵育2h。(7)洗板：重復第五步。(8)向每個孔內(nèi)加1001tL酶作用底物，輕敲混勻，室溫避光孵育30min。(9)向每孔中加入1001．tL終止液，輕敲混勻，以終止反應。(10)用酶標儀450nm波長側(cè)其吸光度，用540nm或570nm波長矯正。(11)計算；根據(jù)吸光度的值，計算巨噬細胞培養(yǎng)基中IL．6的濃度。2．4．3．3注意事項(1)實驗前一定要將試劑盒提前30min放于室溫，否則影響監(jiān)測結(jié)果。(2)酶作用底物一定要避光，顏色變化為無色一藍色一黃色。(3)終止液穿透力很強，千萬不要弄到皮膚上。(4)整個實驗過程中要勤換手套，避免交叉污染。2．4．4檢測培養(yǎng)基中TNF．a(chǎn)水平2．4．4．1實驗準備(1)儀器設(shè)備：酶標儀、1001．tL和10001tL加樣器、200多通道加樣器、加樣槽等。(2)計算：孔數(shù)=(標準曲線(8x2)+樣本數(shù)x2+對照x2)x重復次數(shù)每種試劑總量=孔數(shù)×每孔液體量(3)制冰以放置樣本：將試劑盒置于室溫以平衡試劑溫度(加樣前打開酶標板包裝以減少水汽凝結(jié))。．(4)小鼠TNF．a(chǎn)對照配制：用lml去離子水或蒸餾水溶解對照樣品，充分溶解。(5)洗滌液配制：如果使用前濃縮液出現(xiàn)晶體，拿到室溫輕輕混勻直到晶體溶解，要準備充分的洗液。去25ml濃縮液加入到600ml去離子水或蒸餾36 水中配制成洗滌工作液。(6)酶反應液：在使用前1Stain內(nèi)將顯色劑A和B等體積均勻混合均勻后使用。每孔加入100uL。(7)巨噬細胞TNF．a(chǎn)標準品的配制：用2ml的RD5Z稀釋液溶解IFN．丫標準品(不能用其他的稀釋劑代替)，溶解后的IFN．丫標準品的濃度為1500pg／ml，溶解后的標準品至少要放置5min才能進行后續(xù)的稀釋。(8)拿6個新的15ml離心管，取200肛L的RD5Z稀釋液到每一個15ml離心管中，向第一離心管中加入200“L的TNF．a(chǎn)標準品，此時標準品的濃度為750pg／ml。充分混勻后取200pL加入到第二個離心管中，以此類推，加到第七個離心管。此時從第一管到第六管的濃度分別為：750p∥ml、375pg／ml、187．5pg／ml、93．8pg／ml、46．9pg／ml、23．4pg／ml。以TNF—a儲存液的濃度為最高濃度1500pg／ml，校準液的濃度為最低濃度Opg／ml。2．4．4．2操作步驟(1)計算一下，取下所用酶標板孔，其余酶標板放回鋁箔袋子里。(2)向酶標板的每個孔內(nèi)50肛LRDlW到每一個孔。(3)向加入RDlW的孔內(nèi)加入50斗L標準品、樣品和對照，用粘性的封口膜封住每個孔，輕敲lmin使其均勻，室溫下孵育2h。做好標記，以區(qū)別樣品、對照和標準品?！?4)將孔內(nèi)原有的液體吸出(剩下的液體用吸水紙吸干凈，尤其是最后一步洗板，最為關(guān)鍵)往每個孔里加4009L的洗滌液，用手指輕輕敲擊酶標板的側(cè)壁lrain，使其充分洗滌，重復洗滌5次。(5)向每個孔內(nèi)加入100pL酶標記抗體，用封口膜封口，室溫孵育2h。(6)洗板：重復第五步。(7)向每個孔內(nèi)加1009L酶作用底物，輕敲混勻，室溫避光孵育30min。(8)向每孔中加入100pL終止液，輕敲混勻，以終止反應。(9)用酶標儀450rim波長側(cè)其吸光度，用540nm或570nm波長矯正。(1o)計算；根據(jù)吸光度的值，計算巨噬細胞培養(yǎng)基中IL．6的濃度。2．4．4．3注意事項一一一三j蘭：(1)實驗前一定要將試劑盒提前30rain放于室溫，否則影響監(jiān)測結(jié)果。(2)酶作用底物一定要避光，顏色變化為無色_÷藍色葉黃色。37 (3)終止液穿透力很強，千萬不要弄到皮膚上。(4)整個實驗過程中要勤換手套，避免交叉污染。2．5免疫熒光染色2．5．1實驗注意事項(1)實驗過程中要戴手套，避免污染。(2)熒光染色后一般在1小時完成，或4℃保存4小時，時間過長使熒光減弱。(3)如果細胞易脫落，可以將所有步驟在靜止的桌面上進行，但靜止操作時相應的操作時間或次數(shù)要延長。(4)在每次洗滌的時候，要盡量吸盡殘余的洗滌液，同時要保持6孔板中蓋玻片表面濕潤，不能干掉。(3)每組實驗時，需要設(shè)置一下三種對照；①陽性對照：陽性蛋白+熒光標記物②陰性對照：陰性蛋白+熒光標記物③熒光標記物對照：PBS+熒光標記物2．5．2實驗操作步驟(1)樣品準備：用鑷子將無菌潔凈的蓋玻片放置到6孔板內(nèi)，接種并培養(yǎng)wT、PLTP．／_、RAW264．7細胞，待細胞都貼壁生長良好后進行下一步實驗。(2)固定：吸出培養(yǎng)液，用高壓滅菌PBS洗1．2遍。加1ml免疫染色固定液P0098于6孔板中固定細胞(固定液不要太多，以固定液能覆蓋細胞為標準)，置于側(cè)擺搖床固定5．15分鐘。(3)洗板：吸出固定液P0098，將固定好的細胞用免疫染色洗滌液P0106洗滌兩次，每次5分鐘。(4)力11入lml免疫染色封閉液P0102，置于側(cè)擺搖床上封閉60分鐘(側(cè)擺搖床速度比較緩慢，而且也容易讓溶液覆蓋樣品)。如果背景較高，可以4"C封閉過夜。(5)一抗孵：將封閉液吸出，立即加入稀釋好的NF．r,BP65抗體，室溫側(cè)擺搖床l小時。如一抗孵育1小時效果不佳，可以4"C緩慢搖晃孵育過夜(一抗回收4℃保存，可以重復用多次)。(6)洗板：回收一抗，加入免疫染色洗滌液P0106洗3次，每次5分鐘。38 如背景顏色較高可以適當延長洗滌時間，增加洗滌次數(shù)。(7)--抗孵育：吸出洗滌液，立即加入稀釋好的lml抗兔Cy3，置于側(cè)擺搖床室溫孵育1小時。(8)洗板：回收二抗(4℃保存，可以重復用多次)，方法同第六步。(9)JJH入lml細胞核染色液DAPI，室溫條件下染色5分鐘。(10)洗板：方法同上。最后一次洗完一定要吸盡洗滌液。(11)蛋白檢測：滴加適量的抗熒光猝滅封片液，封好片后直接到熒光顯微鏡下觀察結(jié)果并彩圖保存。2．6統(tǒng)計學處理應用SPSSl3．0統(tǒng)計學軟件對所獲得的數(shù)據(jù)進行分析，實驗組與對照組均采用均數(shù)士標準差(x±S)表示，實驗組與對照組的比較采用單因素方差分析(one．wayANOVA)，采用F統(tǒng)計量。實驗組與對照組均數(shù)比較采用LSD．t和Dunnett．t檢驗，以P0．05)無統(tǒng)計學意義，在60rain和120rain時分別增加33．4％和54％(P<0．02)。PLTPsiRNA組較ControlsiRNA組Ir．_B．(It蛋白在30min(P>0．05)和60min(P>0．05)時無統(tǒng)計學意義(尸>O．05)，在120min減少351．2％(尸=0．043)。免疫熒光染色顯示如圖4．C所示；PLTP．／．BMDM較WT核轉(zhuǎn)位明顯增加。5、LPS誘導的PLTPknockdownRAW264．7和TNF．a(chǎn)誘導的PLTPknockdownHUVEC內(nèi)TAKl磷酸化增強LPS持續(xù)刺激PLTPknockdownRAW264．7以及TNF．a(chǎn)持續(xù)刺激PLTPknockdownHUVEC2小時，提取其胞漿和細胞核中的蛋白，分別用相應的抗體進行檢測。結(jié)果如圖5所示；在PLTPknockdownRAW264．7細胞中PLTPsiRNA組較ControlsiRNA組在120rain時增加了150％(P<0．02)。在PLTPknockdownHUVEC細胞中，PLTPsiRNA組較ControlsiRNA組TAKl磷酸化在120min時增加了1000％(P=0．05)。6、骨髓源性巨噬細胞中加入格列苯脲后未能增加STAT3磷酸化WT和PLTP．／．骨髓源性巨噬細胞培養(yǎng)兩天后，加入ABCAl激動劑格列苯脲30min后加LPS刺激。提取其核蛋白，用相應的抗體進行檢測。結(jié)果如圖所示；在PLTP存在的情況下，pSTAT3的核水平不受格列苯脲的影響，說明在本實驗中PLTP未能激活ABCAl．pSTAT3途徑。7、巨噬細胞分泌的IL．10不能通過STAT3或SOCS3起到抗炎作用LPS刺激PLTPsiRNA或controlsiRNA轉(zhuǎn)染的RAW264．7細胞24h，，提取其胞漿和細胞核中的蛋白，分別用相應的抗體進行檢測。結(jié)果如圖7所示：pSTAT3和SOCS3均未有明顯的變化。41 討論炎癥是機體的一種保護機制，是機體受到外界或體內(nèi)自身的損傷時的一種正常的生理反應。在此過程中，各種炎癥因子及炎細胞共同發(fā)揮作用，以消除機體損傷因素。但是炎癥并非是只有保護作用。在炎癥的整個過程中，某一個環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題，就由可能造成機體更大的損傷，反而成為對機體的不利因素。炎癥不僅僅是抗體消滅抗原，機體將進入體內(nèi)的病原微生物殺死的過程。它涉及到各種組織細胞和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等各種細胞器【36】；它既是一種適應性免疫反應，也是一種固有的免疫反應，涉及到體內(nèi)幾乎所有免疫細胞、免疫通路和細胞因子；它是一種組織損傷反應，又具有強大的組織再塑和修復作用，幾乎涉及到細胞組織的代謝、增殖、遷移、凋亡、自噬、壞死、再生等所有的方面；它既有各種信號分子的特異性；又有各種遺傳背景的變異性，涉及到各種信號通路和上百種基因轉(zhuǎn)錄、表達、修飾、調(diào)控和多態(tài)性的變化。是一個多因素、多細胞、多通路、多層次、進行性的復雜的生理和病理的網(wǎng)絡(luò)性的調(diào)節(jié)反應。在近年的研究發(fā)現(xiàn)，炎癥在疾病的發(fā)生、發(fā)展以及預后中有著不可替代的作用。促炎因子和某些蛋白的表達和分泌是巨噬細胞在急慢性疾病中介導炎癥反應的關(guān)鍵特性【”1。細胞外的PLTP在先天性免疫反應的調(diào)節(jié)已經(jīng)有文獻報道【381，然而細胞內(nèi)的PLTP在炎癥中的作用仍然是不明確的。我們的實驗第一次證實了PLTP缺乏引起以下反應：(1)在腹腔巨噬細胞和骨髓源性巨噬細胞中均增強了LPS誘導的炎癥因子的表達。(2)在巨噬細胞和人臍靜脈上皮細胞中通過TAKl通路增加了NFtcB活性單位P65的核轉(zhuǎn)位。(3)不依賴ABCAl．JAK2．STAT3途徑促進了NFxB激活。(4)在本研究中細胞內(nèi)高水平的IL一10不能減弱TNFa和IL．6的表達。巨噬細胞是人體重要的免疫細胞之一，在全身分布廣泛具有高度的吞噬能力和適應能力強。巨噬細胞和其它免疫細胞在炎癥反應對于機體的防御和病原微生物的清除是非常關(guān)鍵的。巨噬細胞在參與炎癥調(diào)節(jié)的過程中涉及許多細胞因子和免疫蛋白。同時，它還能產(chǎn)生和分泌多種趨化因子和細胞因子，例如IL．1、IL．6、IL．10、IL．12和TNF．a(chǎn)等。巨噬細胞表面有多種受體存在，如TLR4受體、TNF．0【受體、ABCAl受體以及IL．1受體等，而這些受體被激活后均能引起下游炎癥信號通路的激活，從而引起炎癥因子的生成和分泌子。在巨噬細胞中還有多種炎癥信號通路例如JAK、MAPK、PKC、AKT、IKK、TK、Wnt、Notch42 等等，可以通過AP．1、IRF、NF．KB、HIF等多種轉(zhuǎn)錄因子，啟動和促進各種炎癥基因的表達。其中NF．rd3是一個關(guān)鍵的炎癥信號通路，同時由于他還能調(diào)節(jié)許多與炎癥相關(guān)聯(lián)的促炎基因而一直被作為一個促炎因素。然而，在急慢性炎癥中，各種各樣的血漿蛋白顯著增加或被激活并參與炎癥過程的調(diào)節(jié)。近來研究證明炎癥中血漿PLTP活性增加暗示了它在先天性免疫反應中起了重要的作用[39-41】。有文獻報道細胞外的PLTP能抑制NFxB激活通過ABCAl．JAK2．STAT3途徑，然而局部組織PLTP的來源是有限的【33】。此外，在炎癥急性期階段的病人血漿中大量的PLTP減少暗示了細胞外的PLTP在局部炎癥中可能起不了重要作用【401。為了弄清楚細胞內(nèi)PLTP在急性炎癥中的作用，我們分析了目前的研究，發(fā)現(xiàn)PLTP缺乏能促進促炎因子表達，暗示了在巨噬細胞中內(nèi)源性的PLTP能抑制NFrB激活。NFrB激活是介導急慢性炎癥的主要的轉(zhuǎn)錄因子之一，隨后的促炎因子的表達會進一步加重局部組織或細胞的損傷。抑制NFxB激活和降低促炎因子的表達是抗炎藥物治療研發(fā)的一個至關(guān)重要的靶點。我們的研究表明，PLTP可能是～個能夠影響NFxB激活的重要蛋白。另外，VuleticS發(fā)現(xiàn)PLTP能以激活型形式進入胞漿和細胞核，說明PLTP像一個轉(zhuǎn)錄因子一樣穿梭核與質(zhì)的蛋白[42】。然而，各種各樣的急性期階段或先天性免疫蛋白可以與PLTP相互作用，在血漿中形成PLTP蛋白復合體，暗示了磷脂轉(zhuǎn)運蛋白不是一個單純的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白。根據(jù)以往的研究和我們的研究發(fā)現(xiàn)，細胞內(nèi)的PLTP能與NFxB通路中的某些蛋白相互作用或影響蛋白的功能和重塑例如TAKl磷酸化。PLTP是多功能蛋白，不僅存在于血漿中發(fā)揮脂質(zhì)轉(zhuǎn)運作用，而且存在于細胞高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)參與脂蛋白的成熟與分泌。生物體所有組織幾乎都可以合成PLTP，主要的組織為肝臟和脂肪組織。已有文獻報道PLTP能夠在脂蛋白間轉(zhuǎn)移磷脂【431，進而對膽固醇逆向轉(zhuǎn)運有一定的影響。另外，PLTP還能轉(zhuǎn)移維生素E和LPS，暗示了在細胞和血漿中的PLTP能夠調(diào)節(jié)這些分子的分布。細胞外PLTP抗炎的作用包括清除LPS和激活ABCAl．JAK2．STAT3信號通路【3l】。在本研究中，我們通過炎癥過程中分泌的PLTP排除了LPS和ABCAl的影響，驗證了PLTP缺乏是引起NFr,B激活的主要原因。另一方面，有文獻證實，堆積的維生素E能增加脂蛋白的抗氧43 化性和抑制內(nèi)皮細胞功能紊亂【30，4引。暗示了在PLTP存在的情況下，維生素E能更好的發(fā)揮其保護作用。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，PLTP缺乏促進了巨噬細胞中p65亞單位轉(zhuǎn)錄，并增加了胞漿蛋白11(：Ba的降解，p65是Ⅳ^B炎癥信號轉(zhuǎn)導通路中最主要的一個轉(zhuǎn)錄亞單位，它的核轉(zhuǎn)位的增加說明PLTP缺乏對于NFxB是一個激活作用。在PLTPknockdownRAW264．7和knockdownRAWHUVEC的實驗結(jié)果進一步證實了上述結(jié)論。在低PLTP的情況下IL．10明顯的升高。IL．10是由巨噬細胞或T細胞分泌的一種最主要的抗炎細胞因子之一，它的功能是受pSTAT3和抑制p65亞單位轉(zhuǎn)錄的SOCS3調(diào)控的[45】。通過我們的實驗證明升高的IL．10沒有通過STAT3激活或SOCS3的表達而發(fā)揮抗炎作用【461。研究證明在T細胞中IL．10能通過STATl激活抑制IFN吖表達因此在本實驗中LPS誘導的巨噬細胞中IFN．丫表達沒有明顯變化很可能是被升高的IL．10所抑制。總的來說，通過本研究我們證明了LPS誘導的PLTP缺乏的巨噬細胞炎癥因子表達顯著升高。對于相關(guān)機制研究也說明了，在低內(nèi)源性PLTP的細胞中NFKB激活是增強的，NFxB激活增強是胞漿蛋白TAKl磷酸化增加的結(jié)果。暗示了PLTP能與NFxB激活相關(guān)蛋白相互作用。說明了低內(nèi)源性PLTP也能促進炎癥因子的表達。更詳細的信號和分子機制還得進一步的研究。 結(jié)論(1)PLTP缺乏誘導的PDM和BMDM在LPS刺激下炎癥因子表達升高。(2)PLTP缺乏增強了NFr,．B活性亞單位p65核轉(zhuǎn)位水平。(3)RAW264．7和HUVEC中NFr．B活性亞單位p65核轉(zhuǎn)位水平增強可能與TAKl磷酸化作用有關(guān)45 APeritonealMacrophageIL-IOIFN-y附圖TNFolL-6鹺山蘸山廷山蘸山BBoneMarrowDerivedMacrophageIL·10IFN-yTNFaIL．6WrPm．／．WTPLTP．／-WTPLTP．／-WTPL'IP4-CInflammatoryCytokinesSecretedfromBoneMarrowDerivedMacrophageIL·10IFN·YTNFaIL-6岍Pm-，-岍PLTP．，-岍P帥．／．a(chǎn)Media口Media+LPSVVTPLlP．，-Figure1pro-InflammatorycytokinesexpressionwasincreasedinPLTPdeficiencymacrophage．A)Peritonealderivedmacrophage(PDM)wasstimulatedwithLPS(200ng／m1)for24h．TotalRNAwasextractedandmRNAofTNF—a，IL一6，IL一10，andIFN-丫wasevaluatedwithreal—timePCR．ExpressionlevelsofmRNAareindicatedasfolddifferencecomparedwithwildtypegroup(WT)．B)Bonemarrowderivedmacrophage(BMDM)wasstimulatedwithLPS(200ng／m1)for24h．TotalRNAwasextractedandmRNAofTNF一0【，IL-6，IL-10，andIFN一丫wasevaluatedwithreal-timePCR．ExpressionlevelsofmRNAareindicatedasfolddifferencecomparedwithwildtypegroup(WT)．C)AfterLPS(200ng／m1)stimulationfor24h，culturemediaofBMDMwasharvestedandconductedforTNF—a，IL-6，IL-10，andIFN一丫quantizationbyELISA．Dataareexpressedasthemean+SD(n=4)．木，P曼c3^J2一qJ辟一《Z芷￡0他∞8642JE、口c 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綜述磷脂轉(zhuǎn)運蛋白在膽固醇逆向轉(zhuǎn)運中的作用劉帥綜述秦樹存校正摘要心腦血管疾病的最主要病理學改變之一是動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)。膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(reversecholesteroltransport，RCT)是由高密度脂蛋白(highdensitylipoproteinHDL)介導的抗AS機制。經(jīng)典的RCT是指HDL將外周組織堆積的膽固醇通過循環(huán)轉(zhuǎn)運至肝臟，在肝內(nèi)以膽汁的形式經(jīng)由糞便排出體外。血漿HDL分子及生物學特性在RCT過程中起到關(guān)鍵作用。磷脂轉(zhuǎn)運蛋白(Phospholipidstransportprotein，PLTP)參與HDL代謝，可直接影響血漿HDL膽固醇水平、，HDL亞組分比例以及HDL顆粒上成分。因此，PLTP很可能在多個環(huán)節(jié)影響RCT。本文就PLTP與RCT相關(guān)的研究進展作一綜述。AbstractOneoftheuppermostpathologychangesofheartcerebroVasculardiseasesisatherosclerosis(AS)．Theoneofmostimportantanti-atherogenicmechanismsofthegoodcholesterolhighdensitylipoprotein(HDL)ismediatingreversecholesteroltransport(RCT)．TheRCTdescribestheprocesswherebycholesterolinperipheraltissuesistransportedtotheliver(orsmallintestine)whereitisultimatelyexcretedintheformofbile．Thecholesteroltransporters，plasmaproteinsandenzymeswhichinPeripheraltissues、plasma、liversandintestinaltractsallinvolvesRCT．HDLcholesterollevelandbiologicalqualityplayapivotalroleinRCT．Phospholipidtransferprotein(PLTP)isaimportantproteinwhichinvolvesHDLmetabolism，thatcandirectlyimpactsHDLcholesterollevel、proportionofHDLsubgroupsandchangesofHDLcomposition．Therefore，PLTPmayinfluencetheRCTpathwayatmultiplelevels．ThesummaryiswrittenconcerningtherelationshipbetweenPLTPandRCT．關(guān)鍵詞膽固醇逆向轉(zhuǎn)運；磷脂轉(zhuǎn)運蛋白；高密度脂蛋白；動脈粥樣硬化：膽固醇流出KeywordsReversecholesteroltransport；Phospholipidtransferprotein；Highdensity57 lipoprotein；Atherosclerosis；Cholesterolefflux．飲食結(jié)構(gòu)的豐富和生活方式的改變使得心腦血管疾病發(fā)病率急劇升高。AS初始病變是富含膽固醇的脂質(zhì)侵襲動脈內(nèi)膜并在內(nèi)膜下堆積【l】，許多炎癥反應相繼發(fā)生，包括脂蛋白氧化【2。3】、內(nèi)皮細胞改變、單核細胞遷移聚集、泡沫細胞形成等(見圖一)。長期的慢性的炎癥反應會促進免疫反應和脂質(zhì)堆積從而形成AS。膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(reversecholesteroltransport，RCT)fl邕將外周組織中多余的膽固醇轉(zhuǎn)運至肝臟，并在肝臟內(nèi)將其轉(zhuǎn)化成膽酸排出體外，從而抑制AS的形成和發(fā)展(見圖二)。RCT是由多個重要的步驟組成。首先，膽固醇從外周組織流出所需的轉(zhuǎn)運體例如ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體A1(ATPbindingcassettetransporterA1，ABCAl)和G1(ATPbindingcassettetransporterG1，ABCGl)[4．5]等，巨噬細胞和外周細胞內(nèi)多余的膽固醇通過這些轉(zhuǎn)運子被轉(zhuǎn)運到細胞外的膽固醇接受體上，主要是HDL[6。7】。其次，脂質(zhì)接受體，主要是HDL的各種亞型【8】均可作為RCT的傳遞者。第三，脂蛋白相關(guān)蛋白和酶，例如卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(1ecithincholesterolacyltransferase，LCAT)pJ、膽固醇酯轉(zhuǎn)運蛋白(cholesterolestertransportprotein，CETP)、磷脂轉(zhuǎn)運蛋白(phospholipidtransferprotein，PLTP)‘10】。第四，肝細胞表面受體，例如LDL受體、B類I型清道夫受體(scavengerreceptorclassB，typeI，SR—BI)，HDL中的膽固醇酯經(jīng)肝表面的SR．BI受體攝取【11‘121進入肝臟，在肝臟內(nèi)轉(zhuǎn)化成膽酸。一些證據(jù)證實HDL可通過介導動脈內(nèi)膜下泡沫細胞內(nèi)膽固醇的流出而發(fā)揮它的抗動脈粥樣硬化作用的[13-14】。HDL作為RCT過程中的膽固醇接受體，無論是其功能，還是其血漿濃度，對于HDL本身的抗AS生物學活性同樣重要[15-16】。因此，參與HDL形成和修飾的數(shù)個轉(zhuǎn)運蛋白在巨噬細胞膽固醇流出中必然起到關(guān)鍵的作用。其中PLTP無論在細胞內(nèi)、質(zhì)膜還是在循環(huán)中都具有轉(zhuǎn)脂活性，人們長期以來也一直研究其在HDL代謝中的作用。 辮囂}童謗≮圖一、泡沫細胞形成富含膽固醇的脂質(zhì)(主要是LDL)侵襲動脈內(nèi)膜，使內(nèi)皮細胞受損，間隙增大，脂質(zhì)通過損傷的內(nèi)皮細胞間隙在內(nèi)膜下堆積。由于細胞因子的趨化性，T淋巴細胞和單核細胞也通過內(nèi)皮細胞間隙到達內(nèi)膜下。一系列的炎癥反應相繼發(fā)生一脂蛋白氧化、內(nèi)皮細胞改變、平滑肌細胞遷移等。單核細胞在內(nèi)皮下演變?yōu)榫奘杉毎?，吞噬脂質(zhì)和膽固醇而成為巨噬細胞源性泡沫細胞。內(nèi)皮細胞、巨噬細胞、T淋巴細胞均可產(chǎn)生不同細胞因子，刺激中膜平滑肌細胞增生并遷移到內(nèi)膜下，在內(nèi)膜下平滑肌細胞通過LDL受體吞噬OX—LDL及膽固醇而最終成為肌源性泡沫細胞。59■■■毋 圖二、膽固醇逆向轉(zhuǎn)運RCT能將外周細胞多余的膽固醇轉(zhuǎn)運至肝臟或小腸并最終轉(zhuǎn)化成膽酸排除體外。RCT是由多個重要步驟組成的，首先，巨噬細胞和外周細胞內(nèi)多余的膽固醇通過細胞膜上的ABCAl被轉(zhuǎn)運到細胞外的膽固醇接受體上。其次，經(jīng)過LCAT的作用，將膽固醇轉(zhuǎn)化成膽固醇酯。然后，再由CETP將HDL中的膽固醇酯與LDL、VLDL、IDL中的甘油三酯相互交換。最后，VLDL、IDL、LDL通過肝臟或小腸表面的LDL—R受體，將膽固醇酯轉(zhuǎn)運至肝臟。與此同時，HDL繼續(xù)在LCAT的作用下轉(zhuǎn)變成HDL2，HDL2也可通過CETP與VLDL、IDL、LDL進行膽固醇酯和甘油三酯的交換。最終，HDL2通過肝或小腸表面的SR-BI受體，將膽固醇酯轉(zhuǎn)運到肝臟。大量研究發(fā)現(xiàn)，PLTP屬于脂多糖結(jié)合與脂肪轉(zhuǎn)運蛋白家族，還包括脂多糖結(jié)合蛋白(1ipopolysaccharidebindingprotein，LBP)，殺菌滲透性增強蛋白(bactericidal／permeability-increasingprotein，BPI)和膽固醇酯轉(zhuǎn)運蛋白(CETP)t"‘1引。PLTP是多功能蛋白，不僅存在于血漿中發(fā)揮脂質(zhì)轉(zhuǎn)運作用，∞ 而且存在于細胞高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)參與脂蛋白的成熟與分泌。生物體所有組織幾乎都可以合成PLTP，主要的組織為肝臟和脂肪組織，并且在血漿、胎盤、胰腺、脂肪組織、腦和肺中呈高表達【19】。就轉(zhuǎn)運蛋白的特性來講，PLTP自身特點明確，PLTP在脂蛋白代謝中的主要作用是轉(zhuǎn)移磷脂，即從脂解中的乳糜微粒、極低密度脂蛋白(VLDL)和低密度脂蛋白(LDL)殘粒向HDL轉(zhuǎn)移磷脂，使HDL顆粒增大。循環(huán)內(nèi)PLTP結(jié)合于HDL并介導單層囊泡間磷脂的凈轉(zhuǎn)運至HDL，也介導脂蛋白間的磷脂交換【201。磷脂凈轉(zhuǎn)運至HDL會導致更大的、低密度的HDL亞群產(chǎn)生。血漿PLTP是一種非特異性的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白，它能轉(zhuǎn)運多數(shù)磷脂。除磷脂之外，甘油二酯、維生素E、腦苷脂和脂多糖也能有效的被轉(zhuǎn)運121】。盡管膽固醇脂轉(zhuǎn)運蛋白也能轉(zhuǎn)運磷脂，但在模型鼠中顯示PLTP不能代替CETP的功能‘221。一、PLTP與HDL1、PLTP過表達對HDL的影響磷脂轉(zhuǎn)運蛋白對HDL有至關(guān)重要的作用，過表達PLTP是否能提升血漿及外周組織中HDL的水平，同時又能增強HDL顆?？箘用}粥樣硬化的特性呢?有人對此也做了研究，通過腺病毒和腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染的方法實現(xiàn)了PLTP在C57BL／6dx鼠體內(nèi)的過表達，結(jié)果顯示，前者使血漿PLTP活性增加了10-40倍【23。24】，在增加了血漿prelB．HDL水平的同時降低了a．HDL膽固醇的水平。后者使C57BL／6dx鼠血漿中總膽固醇和HDL膽固醇都有顯著地減少【241。通過轉(zhuǎn)基因的方法使人的PLTP基因在小鼠體內(nèi)過表達，結(jié)果顯示，與野生型相比，血漿PLTP活性增加了2．5—4．5倍。與此同時，血漿中HDL膽固醇的水平降低了30％．40％t251。Moerland等人通過研究人PLTP和apoAl的轉(zhuǎn)基因鼠發(fā)現(xiàn)，PLTP基因呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，并導致HDL顆粒的抗AS的特性丟失【261。由此可見，PLTP過表達時循環(huán)中HDL的水平顯著降低，減弱了HDL抗AS特性。2、PLTP缺乏對HDL的影響綜上，PLTP在小鼠體內(nèi)過表達對HDL是個不利因素。然而PLTP缺乏時HDL的功能又會怎樣?到目前為止，大部分關(guān)于PLTP的研究數(shù)據(jù)都是從PLTP基因敲出的小鼠獲得的，數(shù)據(jù)顯示PLTP基因敲除之后，卵磷脂(phosphatidylch01ine，PC)、腦磷脂(phosphatidylethanolamin，PE)、磷脂酰肌醇(phosphatidylinosito，PI)和鞘磷脂(sphingomyelin，SM)I拘轉(zhuǎn)運活性完全喪61 失，自由膽固醇(freecholesterol，F(xiàn)C)l約轉(zhuǎn)運活性部分喪失【2”。而且，在PLTP基因敲除鼠的在體實驗發(fā)現(xiàn)，氫3標記的卵磷脂被清除了，在VLDL和LDL中也都沒有發(fā)現(xiàn)。普通飲食喂養(yǎng)C57BLdx鼠，HDL中磷}]旨(phospholipid，PL)、FC和apoAl都顯著的減少，證明了PLTP介導的富含甘油三酯脂蛋白表面成分的轉(zhuǎn)運在維持HDL水平時扮演了重要的角色【271。同時有實驗證實PLTP缺乏提高了HDL抗炎癥的性能，降低了LDL對于單核細胞趨化的敏感性‘281。此外，來自PLTP基因敲除小鼠的HDL富含蛋白，缺乏磷脂。一HDL和膽固醇酯的更新率(turnoverstudies)研究表明與野生型小鼠(C57BL)相比增加了四倍以上。因此，PLTP缺乏狀態(tài)也會造成循環(huán)中HDL膽固醇和磷脂水平的顯著降低，但HDL抗炎癥的性能有所增強。二、PLTP與AS1、PLTP過表達對AS影響PLTP在維持內(nèi)環(huán)境的脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)方面，以及AS發(fā)展過程中的病理學作用仍然不是十分明了。研究表明在能增加冠心病風險的不同疾病中，像肥胖、胰島素抵抗、I型II型糖尿病，PLTP的表達是增加的【291。血清PLTP活性與左心室收縮功能紊亂【301和低HDL水平成正相關(guān)性【311?？焖偬岣哐獫{中PLTP的濃度，能加重已存在的ASt321，并且在PLTP轉(zhuǎn)基因鼠[331和過表達PLTP的apoE基因敲除鼠的研究證明，PLTP過表達都有促進AS的作用【241。顯然，PLTP與AS的形成關(guān)系密切，PLTP過表達對AS是一個促進因素。2、PLTP缺乏對AS影響關(guān)于PLTP缺乏對AS的影響的研究，科研工作者也做了大量的工作。有文獻報道PLTP敲初小鼠有一個低的血漿膽固醇水平，并能抵抗由飲食誘導而引起的AS[341。Valenta等的研究也證明在全身PLTP缺乏，僅在巨噬細胞表達的PLTP有動脈粥樣硬化保護作用f351。這種表現(xiàn)型能通過增強PLTP和ABCAl相互作用得以證實【361，在增強PLTP和ABCAl相互作用的情況下，能使穩(wěn)定的HDL與ABCAl綁定并增加了膽固醇和磷脂的流出率【371。在人的頸動脈組織截面中，檢測到PLTP的免疫反應性【38。39】。而且，在動脈粥樣硬化切片中，PLTP與apoA．I、apoE和雙糖鏈蛋白多糖一起堆積在細胞外基質(zhì)。這些發(fā)現(xiàn)提示了PLTP可能會促進HDL和雙糖連蛋白多糖的綁定。PLTP通過增強細胞表面的綁定和HDL重塑，提高膽固醇和磷脂從巨噬細胞流出的能力1371。因此，62 以上數(shù)據(jù)顯示全身PLTP缺乏而僅在損傷部位的巨噬細胞中表達能促進RCT，對AS是一種保護作用。三、PLTP與RCT‘I、PLTP過表達對RCT的影響PLTP在RCT中的作用是有爭議的。PLTP在巨噬細胞中高表達和調(diào)控，暗示了PLTP在巨噬細胞膽固醇和磷脂流出中是有作用的。Oram[361報道說，外源性PLTP能模仿HDL載脂蛋白的功能，通過ABCAl途徑將膽固醇和磷脂從細胞內(nèi)移出。PLTP能通過與ABCAl的相互作用以媒介的形式將過多的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運到脂蛋白上【361。還有文獻報道，在血漿中用兩種形式的PLTP，一種是高活性的PLTP(HA．PLTP)，一種是低活性I拘PLTP(LA．PLTP)[40‘41】。無論是高活性PLTP，還是低活性I約PLTP都能增強膽固醇流向apoAl[42】。證明，PLTP在不同的膽固醇流出模型中可以扮演促膽固醇流出的作用，對RCT是有促進作用的?！?、PLTP缺乏對RCT的影響另一方面，研究者也得到了一些相反地結(jié)果。有研究發(fā)現(xiàn)PLTP缺乏不能顯著地改變巨噬細胞膽固醇流出的能力‘431，在巨噬細胞中過表達也是一樣的結(jié)果【441。Moerlandt261研究也發(fā)現(xiàn)從PLTP和apoAl雙基因轉(zhuǎn)染小鼠分離獲得的HDL比單轉(zhuǎn)染apoAl基因小鼠的HDL效率低。由此看出，PLTP在RCT中沒有沒明顯的作用，甚至有抑SURCT的作用。結(jié)論PLTP是否在RCT中起重要作用尚不十分明確。然而，PLTP能影響脂蛋白的重塑和功能，因此，在動脈粥樣硬化過程中一定是有顯著作用的。就目前已發(fā)表的文獻資料看，PLTP對RCT是有影響的(促進或抑制)，但是影響并非很強，且不容易解釋在其它模型中扮演的角色。PLTP在局部巨噬細胞和組織中表達的特性和功能與其在循環(huán)中是不同的。在局部表達的PLTP有較強抗動脈制樣硬化的作用，而循環(huán)中的PLTP則偏重于促動脈粥樣硬化的作用。我們目前的研究是有限的，為了研究清楚PLTP在RCT以及AS中的作用，還需要做大量的工作，尤其應注意選用更為合適的動物模型，同時加強人群樣本的研究。大量流行病學的研究也會給我們指導性的見解。最后，人類遺傳性PLTP缺乏的病人，對于我們研究轉(zhuǎn)運蛋白在脂蛋白代謝和AS中的作用是非63 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原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所呈交的學位論文，是本人在導師的指導下，獨立進行研究所取得的成果。除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的科研成果。對本文的研究作出重要貢獻的個人和集體，均已在文中以明確方式標明。本人完全意識到本聲明的法律責任由本人承擔。論文作者簽名：日期：型呈：塵：影學位論文知識產(chǎn)權(quán)權(quán)屬聲明本人在導師指導下所完成的學位論文及相關(guān)的成果，知識產(chǎn)權(quán)歸屬學校。學校享有以任何方式發(fā)表、復制、公開閱覽、借閱、檢索以圾申請專利等權(quán)利。本人離校后發(fā)表或使用學位論文或與該論文直接相關(guān)的學術(shù)論文或成果時，署名單位仍然為泰山醫(yī)學院。論文作?：碑?名：船