克氏原螯蝦轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)發(fā)掘和性腺發(fā)育相關(guān)基因功能初步研究

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1、學(xué)校代碼：10264研究生學(xué)號(hào)：D120101005上海海洋大學(xué)博士學(xué)位論文克氏原螯蝦轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)發(fā)掘和性腺發(fā)育題目：相關(guān)基因功能初步研究TranscriptomeDataMiningofProcambarus英文題目：clarkiiandPreliminaryFunctionalStudyofItsGonadalDevelopmentRelatedGenes專(zhuān)業(yè)：水產(chǎn)養(yǎng)殖研究方向：水產(chǎn)動(dòng)物種質(zhì)資源與遺傳育種姓名：姜虎成指導(dǎo)教師：李家樂(lè)教授二O一五年四月上海海洋大學(xué)學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：我恪守學(xué)術(shù)道德，崇尚嚴(yán)謹(jǐn)學(xué)風(fēng)

2、。所呈交的學(xué)位論文，是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下，獨(dú)立進(jìn)行研究工作所取得的成果。除文中已經(jīng)明確注明和引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的作品及成果的內(nèi)容。論文為本人親自撰寫(xiě)，我對(duì)所寫(xiě)的內(nèi)容負(fù)責(zé)，并完全意識(shí)到本聲明的法律結(jié)果由本人承擔(dān)。學(xué)位論文作者簽名：日期：年月日上海海洋大學(xué)學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書(shū)學(xué)位論文作者完全了解學(xué)校有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，同意學(xué)校保留并向國(guó)家有關(guān)部門(mén)或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許論文被查閱或借閱。本人授權(quán)上海海洋大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，可以

3、采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存和匯編本學(xué)位論文。保密□本學(xué)位論文屬于，在年解密后適用本版權(quán)書(shū)。不保密□學(xué)位論文作者簽名：指導(dǎo)教師簽名：日期：年月日日期：年月日I上海海洋大學(xué)博士學(xué)位論文答辯委員會(huì)成員名單姓名工作單位職稱(chēng)備注陳立僑華東師范大學(xué)教授主席盧大儒復(fù)旦大學(xué)教授委員施志儀上海海洋大學(xué)教授委員成永旭上海海洋大學(xué)教授委員邱高峰上海海洋大學(xué)教授委員牛東紅上海海洋大學(xué)副教授秘書(shū)上海海洋大學(xué)答辯地點(diǎn)答辯日期2015.6.10水產(chǎn)與生命學(xué)院C217II上海海洋大學(xué)博士學(xué)位論文克氏原螯蝦轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)發(fā)掘和性腺發(fā)育相關(guān)基因功能初步研

4、究摘要克氏原螯蝦（Procambarusclarkii）俗稱(chēng)小龍蝦，是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)蝦類(lèi)。目前，克氏原螯蝦人工養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅猛。克氏原螯蝦人工養(yǎng)殖過(guò)程中，苗種來(lái)源主要是存塘親本自繁后代或者是天然水域捕撈，優(yōu)質(zhì)苗種的缺乏一定程度上約束了整個(gè)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。性腺發(fā)育是甲殼動(dòng)物進(jìn)行有性生殖的基礎(chǔ)，研究克氏原螯蝦性腺發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制，將有助于了解其性腺發(fā)育過(guò)程特征。有關(guān)克氏原螯蝦性腺發(fā)育機(jī)制的分子生物學(xué)研究較少，NCBI的GenBank序列數(shù)據(jù)庫(kù)中相關(guān)基因的信息也比較匱乏。大量挖掘、獲取克氏原螯蝦性腺發(fā)育相關(guān)基因，具有重要的理論和實(shí)踐意義

5、。本研究結(jié)合高通量測(cè)序、RACE、qRT-PCR和Western-blot等技術(shù)對(duì)克氏原螯蝦性腺發(fā)育相關(guān)基因的分子調(diào)控機(jī)制展開(kāi)研究。首先對(duì)克氏原螯蝦性腺轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)進(jìn)行高通量測(cè)序，獲得了大量EST序列。通過(guò)分析性腺發(fā)育相關(guān)基因pcna、foxL2和成熟促進(jìn)因子（MPF）在性腺發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)變化，對(duì)其分子調(diào)控機(jī)制進(jìn)行初步探討。篩選到了大量EST-SSR分子標(biāo)記，為克氏原螯蝦群體遺傳結(jié)構(gòu)分析、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建和QTL定位等相關(guān)研究提供參考。主要研究結(jié)果如下：1.克氏原螯蝦轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序及分析利用454高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)克氏原螯蝦

6、精巢和卵巢組織文庫(kù)進(jìn)行分析，獲得了1,134,993條高質(zhì)量的原始序列，序列平均長(zhǎng)度832bp，總量達(dá)943.84Mb。原始序列經(jīng)聚類(lèi)組裝，產(chǎn)生了22,652個(gè)isotigs序列，平均長(zhǎng)度為1,921bp，其中有16,018個(gè)isotigs序列長(zhǎng)度大于1000bp。將拼接得到的isotig序列與公共數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性搜索、比對(duì)和功能注釋?zhuān)诰才c卵巢比較轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)中，共發(fā)現(xiàn)了3858個(gè)差異表達(dá)的isotigs序列，其中1,720個(gè)isotigs序列在卵巢中高表達(dá)，2138個(gè)isotigs序列在精巢中高表達(dá)。結(jié)合已報(bào)道的相關(guān)文獻(xiàn)資

7、料，鑒定、篩選出III上海海洋大學(xué)博士學(xué)位論文了一大批性腺發(fā)育相關(guān)的候選基因。另外，基于測(cè)序產(chǎn)生的大量EST序列篩查到數(shù)量眾多的分子標(biāo)記位點(diǎn)。本研究中構(gòu)建的高質(zhì)量的克氏原螯蝦轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)，可為后續(xù)開(kāi)展克氏原螯蝦性腺發(fā)育相關(guān)的功能基因研究和分子遺傳育種等提供重要參考。2.克氏原螯蝦EST-SSR分布特征及引物的開(kāi)發(fā)利用基于克氏原螯蝦轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)高通量測(cè)序產(chǎn)生的22,652個(gè)EST序列，檢索到6,724個(gè)SSRs位點(diǎn)，平均140kb序列中出現(xiàn)一個(gè)SSR位點(diǎn)。其中二堿基復(fù)類(lèi)型最多，大約占57.56%，且以AC堿基重復(fù)類(lèi)型最為豐富。隨機(jī)挑

8、選100個(gè)EST-SSR位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中55對(duì)引物可擴(kuò)增出清晰的目的條帶，進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)有26對(duì)引物具有多態(tài)性，占可擴(kuò)增出產(chǎn)物引物的47%。用克氏原螯蝦盱眙群體檢測(cè)其中8對(duì)引物的多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)8對(duì)引物的等位基因數(shù)（NA）介于3～11之間；觀測(cè)雜合度（HO）介于0