《基于rna-seq技術(shù)分析小麥矮縮病毒侵染后小麥的基因表達(dá)差異》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。
密級(jí):論文編號(hào):中囯農(nóng)業(yè)科學(xué)院學(xué)位論文基于RNA-Seq技術(shù)分析小麥矮縮病毒侵染后小麥的基因表達(dá)差異AnalysisofGeneExpressionChangesinWheatLeavesinResponsetoWDVInfectionUsingRNA-Seq碩士研究生：王亮指導(dǎo)教師：劉艷副研宄員申清學(xué)位類別：農(nóng)學(xué)碩士專業(yè)：植物病理學(xué)研究方向：分子植物病理學(xué)培養(yǎng)單位：植物保護(hù)研究所研究生院2015年5月 獨(dú)創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的研究成果，也不包含為獲得中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書(shū)而使用過(guò)的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說(shuō)明并表示了謝意。研究生簽名：1I時(shí)間：2〇冰年太月>7曰關(guān)于論文使用授權(quán)的聲明本人完全了解中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院有權(quán)保留送交論文的復(fù)印件和磁盤(pán)，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。同意中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院可以用不同方式在不同媒體上發(fā)表、傳播學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容。研究生簽名時(shí)間：>丨夕年女月曰 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文評(píng)閱人、答辯委員會(huì)簽名表論文題目基于RNA-Seq技術(shù)分析小麥矮縮病毒侵染后小麥的基因表達(dá)差異論文作者王亮專業(yè)植物病理學(xué)|研究方向分子植物病理學(xué)指導(dǎo)教師劉艷培養(yǎng)單位（研究所）植物保護(hù)研究所碩（博）姓名職稱單位專業(yè)簽名導(dǎo)師評(píng)閱人答辯主席碩導(dǎo)口盲評(píng)博導(dǎo)口碩導(dǎo)口博導(dǎo)口研究員碩導(dǎo)口中國(guó)科學(xué)院微生物研方榮祥微生物學(xué)院士博導(dǎo)V究所碩導(dǎo)口生物化學(xué)與李毅教授北京大學(xué)博導(dǎo)V分子生物學(xué)碩導(dǎo)口中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物周雪平教授植物病理學(xué)博導(dǎo)V保護(hù)研究所答碩導(dǎo)口范在豐教授中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)博導(dǎo)V辯碩導(dǎo)口韓成貴教授中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)博導(dǎo)V委碩導(dǎo)口博導(dǎo)口員碩導(dǎo)口博導(dǎo)口碩導(dǎo)口會(huì)議記錄（秘書(shū)）李莉論文答辯時(shí)間地點(diǎn)2015年5月17日，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所 Secrecy:No.ChineseAcademyofAgriculturalSciencesDissertationAnalysisofGeneExpressionChangesinWheatLeavesinResponsetoWDVInfectionUsingRNA-SeqM.S.Candidate：WangLiangSupervisor：AssociateProf.LiuYanMajor：PlantPathologySpecialty:MolecularPlantPathologyMay2015 摘要由小麥矮縮病毒（Wheatdwarfvirus,WDV）引起、介體異沙葉蟬(PsammotettixstriatusL.)傳播的小麥矮縮病是麥類作物生產(chǎn)上一類重要的雙生病毒病害，其危害日益嚴(yán)重，然而目前關(guān)于該病毒致病的分子機(jī)理尚無(wú)深入研究。本研究利用RNA-Seq測(cè)序技術(shù)對(duì)WDV侵染下小麥在RNA水平上的基因表達(dá)變化情況進(jìn)行分析，篩選與病毒癥狀誘導(dǎo)以及植物抗病相關(guān)的差異表達(dá)基因，利用qPCR方法對(duì)選擇的差異表達(dá)基因進(jìn)行驗(yàn)證，還對(duì)WDV誘導(dǎo)的寄主miRNA表達(dá)差異做以分析。通過(guò)在轉(zhuǎn)錄組水平上對(duì)WDV與小麥互作的動(dòng)態(tài)特性進(jìn)行分析，闡明了小麥矮縮病癥狀的形成和發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，為進(jìn)一步解釋病毒致病的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。首先，利用RNA-Seq技術(shù)對(duì)WDV侵染下小麥轉(zhuǎn)錄組表達(dá)情況進(jìn)行深度測(cè)序，經(jīng)數(shù)據(jù)拼接與聚類分析后共獲得了77221條unigenes，與健康對(duì)照組比較得到了4324個(gè)顯著差異表達(dá)的基因，GO功能注釋結(jié)果顯示差異表達(dá)基因主要涉及的生物學(xué)過(guò)程有衰老、生物刺激反應(yīng)、基因沉默、植物激素代謝、光合作用、DNA代謝、植物防衛(wèi)反應(yīng)等。篩選出與植物激素代謝、光合作用及植物防衛(wèi)反應(yīng)等相關(guān)的共23個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行qPCR驗(yàn)證。結(jié)果表明：受WDV侵染的小麥植株表現(xiàn)嚴(yán)重矮化和分蘗異常等癥狀，這可能與赤霉素、生長(zhǎng)素、油菜素甾醇等合成或運(yùn)輸相關(guān)基因的表達(dá)變化以及細(xì)胞分裂素代謝失調(diào)有關(guān)；而光合作用相關(guān)酶以及葉綠素代謝中某些基因的差異表達(dá)，可能導(dǎo)致葉片褪綠黃化癥狀的發(fā)生?？寡趸緩?、基因沉默等途徑的相關(guān)基因的差異表達(dá)反映了植物抵抗病毒侵染所啟動(dòng)的防御反應(yīng)發(fā)生情況。總之，WDV的侵染打破了植物體內(nèi)各種激素之間或多個(gè)代謝途徑的動(dòng)態(tài)平衡。同時(shí)，利用RNA-Seq高通量測(cè)序技術(shù)分析了WDV侵染下小麥體內(nèi)miRNA的差異表達(dá)情況。對(duì)10個(gè)顯著差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)以及GO功能注釋。結(jié)果表明，這些受到miRNA調(diào)控的靶標(biāo)基因主要是生長(zhǎng)素響應(yīng)因子、微管蛋白折疊輔因子、鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)子、水解酶、細(xì)胞色素P450以及一些植物抗病相關(guān)蛋白等。以靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果為契合點(diǎn)，對(duì)miRNA與mRNA差異分析結(jié)果進(jìn)行了負(fù)相關(guān)聯(lián)合分析，結(jié)果獲得了一些重要的調(diào)控信息。例如，受tae-miR5384-3p調(diào)控的FACTcomplexsubunitSPT16在轉(zhuǎn)錄、復(fù)制以及DNA修復(fù)方面發(fā)揮重要作用；受tae-miR2275-3p調(diào)控的三角狀五肽重復(fù)蛋白（Pentatricopeptiderepeat）與植物葉片內(nèi)葉綠素含量以及葉綠體發(fā)育過(guò)程相關(guān)；受tae-miR1123調(diào)控的橡膠延伸因子（Rubberelongationfactor）與植物防衛(wèi)反應(yīng)有關(guān)；tae-miR160的靶標(biāo)基因?yàn)楦哂H和性鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Highaffinitypotassiumtransporter）；tae-miR9774的靶標(biāo)基因?yàn)閰⑴c細(xì)胞凋亡及防衛(wèi)反應(yīng)的含有NB-ARC結(jié)構(gòu)域的抗病相關(guān)蛋白（NB-ARCdomain-containingdiseaseresistanceprotein）等等。此外，還利用植物雙元表達(dá)載體pLH9000構(gòu)建了WDV中國(guó)分離物的侵染性克隆，并成功在小麥上建立侵染，為進(jìn)一步研究病毒致病性提供了有效的工具。關(guān)鍵詞：小麥矮縮病毒，小麥，高通量測(cè)序，侵染性克隆，致病性I AbstractWheatdwarfdiseaseisbecominganincreasinglyseveregeminivirusdiseaseontriticeaecropswhichcausedbyWheatdwarfvirus(WDV)andtransmittedbyPsammotettixstriatusL.Theexactpathogenesisofthisdiseasehavenotbeendeeplyexplored.Inthispresentstudy,RNA-Seqwasusedforgeneexpressionanalysisinwheatinresponsetowheatdwarfvirusinfection.DifferentiallyexpressedgenesrelatedtosymptomsandplantdefenseresponsewerevalidatedbyqPCR.Inaddition,differentiallyexpressedmiRNAwereanalyzedpreliminarily.Theseresultsillustratethedynamicnatureofthewheat–WDVinteractionatthetranscriptomelevelandconfirmthatsymptomdevelopmentisacomplexprocessthatcanbethebasistofurtherunderstandpathogenesisofWDV.Firstly,comparativetranscriptomeprofilingofTriticumaestivumL.inresponsetowheatdwarfvirusinfectionwasconductedbyRNA-Seq.Atotalof77221unigeneswereavailableafterTrinityassemblyandclusteranalysis,4324ofwhichweredifferentiallyexpressedifcomparedtothecontrol.Geneontology(GO)annotationrevealedthatalistofcandidategenesinvolvedinaging,responsetobioticstimulus,genesilencing,phytohormonemetabolism,photosynthesis,DNAmetabolicprocessre,regulationofdefenseresponseandsoon.Twenty-threedifferentiallyexpressedgenesassociatedwithphytohormonemetabolism,photosynthesisandplantdefenseresponsewereselectedandvalidatedbyqPCR.Theresultsindicatedthatmetabolismchangesandtransportsuppressionofauxin,gibberellinsandbrassinosteroidmaycontributetoseveredwarfismintheinfectedwheatplants.Abnormaltilleringmaybeduetothemetabolicdisorderaboutauxinandcytokinin.Furthermore,genesexpressionchangerelatedtophotosyntheticenzymesandchlorophyllmayinducechlorosisofleaves.Inaword,theWDVinfectionbrokethedynamicequilibriumamongsomekindsofphytohormoneormetabolicpathway.Differentiallyexpressedgenesinvolvedinantioxidantorgenesilencingpathwaysrevealedthedefenseresponseagainstvirusinfection.Meanwhile,thedifferentialexpressionoftheknownmaturemiRNAsinthesampleswasdiscoveredbyRNA-Seq.Thedataanalysisofhigh-throughputsequencingshowedthattheexpressionpatternsof10miRNAsinleaveshadbeensignificantlychangedinresponsetoWDVinfection.TheirtargetgeneswerepredictedbypsTargetsoftware.GOanalysisdemonstatedthattheyweremainlyinvolvedinauxinresponsefactor,tubulinfoldingcofactor,potassiumtransporter,hydrolase,cytochromeP450familyproteinandsomediseaseresistanceprotein.ThensignificantinformationwasobtainedaccordingtonegativecorrelationanalysisbetweendifferentiallyexpressedgenesandmiRNAs:tae-miR5384-3ptargetsFACTcomplexsubunitSPT16whichplaysimportantrolesduringDNAtranscription,replicationandrepair;tae-miR2275-3ptargetsPentatricopeptiderepeatwhichisassociatedwiththechlorophyllcontentandchloroplastdevelopment;tae-miR1123targetsRubberelongationfactorwhichisrelatedtoplantdefenseresponse;tae-miR160targetshighaffinitypotassiumtransporter;tae-miR9774targetsNB-ARCdomain-containingdiseaseresistanceproteininvolvedinapoptosisanddefenseresponse.TheresultsprovidenewinsightsintotheregulatorynetworksofmiRNAsandtheirtargetsinresponsetovirusinfection.II Inaddition,aWDVinfectiouscloneofChinaisolatehadbeensuccessfullyconstructedandusedtoinfectwheat(TriticumaestivumL.).ItprovidedausefultoolforstudyofpathogenesisaboutWDV.Keyword:Wheatdwarfvirus,TriticumaestivumL.,high-throughputsequencing,infectiousclone,pathogenicityIII 目錄第一章引言....................................................................................................................11.1小麥矮縮病毒概述.....................................................................................................11.1.1WDV的分類地位及危害.....................................................................................11.1.2WDV的復(fù)制及轉(zhuǎn)錄調(diào)控.....................................................................................21.2植物病毒誘導(dǎo)癥狀形成的分子機(jī)制.........................................................................31.2.1病毒與寄主植物互作誘發(fā)癥狀形成...................................................................31.2.2miRNA等與癥狀形成的關(guān)系..............................................................................51.3高通量測(cè)序技術(shù)及侵染性克隆在植物與病毒研究中的應(yīng)用.................................71.3.1高通量測(cè)序技術(shù)在研究植物與病毒及其互作關(guān)系中的應(yīng)用...........................71.3.2侵染性克隆在病毒研究中的應(yīng)用.....................................................................101.4本研究的目的及意義...............................................................................................12第二章小麥矮縮病毒侵染小麥的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及差異表達(dá)基因分析..........................132.1材料與方法...............................................................................................................132.1.1材料.....................................................................................................................132.1.2方法.....................................................................................................................132.2結(jié)果與分析...............................................................................................................152.2.1小麥轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的處理與生物信息學(xué)分析.....................................................152.2.2目標(biāo)基因的選擇.................................................................................................242.2.3熒光定量PCR方法對(duì)差異表達(dá)基因的驗(yàn)證...................................................262.3總結(jié)與討論...............................................................................................................292.3.1WDV誘導(dǎo)寄主矮化癥狀的原因分析...............................................................302.3.2WDV誘導(dǎo)感病寄主分蘗異常的原因分析.......................................................302.3.3WDV侵染對(duì)寄主光合作用的影響...................................................................312.3.4WDV侵染以后寄主防御機(jī)制的啟動(dòng)...............................................................31第三章小麥矮縮病毒侵染誘導(dǎo)寄主miRNA差異表達(dá)的初步分析...........................333.1材料與方法...............................................................................................................333.1.1材料.....................................................................................................................333.1.2方法.....................................................................................................................333.2結(jié)果與分析...............................................................................................................333.2.1miRNA表達(dá)量的計(jì)算及差異表達(dá)miRNA的篩選.........................................33IV 3.2.2差異表達(dá)miRNA的靶基因預(yù)測(cè)......................................................................343.2.3差異基因與差異miRNA的負(fù)相關(guān)聯(lián)合分析..................................................363.2.4miRNA調(diào)控靶基因的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建........................................................................373.3總結(jié)與討論...............................................................................................................37第四章小麥矮縮病毒中國(guó)分離物侵染性克隆的構(gòu)建..................................................394.1材料與方法...............................................................................................................394.1.1材料.....................................................................................................................394.1.2方法.....................................................................................................................394.2結(jié)果與分析...............................................................................................................444.2.1侵染性克隆表達(dá)載體的構(gòu)建.............................................................................444.2.2農(nóng)桿菌針刺法侵染小麥及病毒檢測(cè).................................................................484.3總結(jié)與討論...............................................................................................................51第五章全文結(jié)論與展望..................................................................................................525.1結(jié)論...........................................................................................................................525.2展望...........................................................................................................................53參考文獻(xiàn)..............................................................................................................................54附錄..................................................................................................................................61致謝..................................................................................................................................64作者簡(jiǎn)歷..............................................................................................................................65V 英文縮略表英文縮寫(xiě)英文全稱中文名稱WDVWheatdwarfvirus小麥矮縮病毒CMVCucumbermosaicvirus黃瓜花葉病毒BMVBromemosaicvirus雀麥花葉病毒TMVTobaccomosaicvirus煙草花葉病毒RDVRicedwarfvirus水稻矮縮病毒PVYPotatovirusY馬鈴薯Y病毒TNVTobacconecrosisvirus煙草壞死病毒SMVSoybeanmosaicvirus大豆花葉病毒RNAiRNAinterferenceRNA干擾siRNASmallinterferingRNA小干擾RNALIRLongIntergenicRegion長(zhǎng)基因間隔區(qū)RCARollingCircleAmplification滾環(huán)擴(kuò)增SSRSimpleSequenceRepeat簡(jiǎn)單重復(fù)序列CTKCytokinin細(xì)胞分裂素IAAIndole-3-aceticacid吲哚乙酸ZR+ZZeatinribosideandzeatin玉米素核苷和玉米素GAGibberellins赤霉素ABAAbscisicacid脫落酸SODSuperoxidedismutase超氧化物歧化酶PODPeroxidase過(guò)氧化物酶PPOPolyphenoloxidases多酚氧化酶VIGSVirusInducedGeneSilencing病毒誘導(dǎo)的基因沉默核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加RuBisCORibulosebisphosphatecarboxylaseoxygenase氧酶GOGeneOntology基因本體論VI 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第一章引言第一章引言1.1小麥矮縮病毒概述1.1.1WDV的分類地位及危害小麥矮縮病毒（Wheatdwarfvirus,WDV）是雙生病毒科（Geminiviridae）玉米線條病毒屬（Mastrevirus）成員（第I亞組），病毒顆粒呈孿生形態(tài)，寄主范圍廣泛，可以侵染包括小麥、大麥、燕麥在內(nèi)的多種禾本科植物及雜草。小麥矮縮病毒基因組編碼四個(gè)蛋白：外殼蛋白（Coatprotein,CP）、運(yùn)動(dòng)蛋白(Movementprotein,MP)以及兩個(gè)復(fù)制相關(guān)蛋白(Replication-associatedproteins,Rep和RepA）。病毒全基因組中包含有兩個(gè)非編碼區(qū)：長(zhǎng)基因間隔區(qū)（Longintergenicregion,LIR）包含在病毒DNA鏈的復(fù)制起始區(qū)以及兩條鏈基因轉(zhuǎn)錄的起始區(qū)之中，短基因間隔區(qū)（Shortintergenicregion,SIR）存在于轉(zhuǎn)錄終止區(qū)以及互補(bǔ)鏈的復(fù)制起始區(qū)。Rep和RepA由病毒互補(bǔ)鏈編碼，兩個(gè)蛋白N端序列相同，病毒鏈則編碼MP和CP蛋白（Boulton，2002）。1985年，MacDowell等分析了瑞典分離物中WDV的全基因序列，證實(shí)序列中存在的四個(gè)反向重復(fù)序列可能與形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)有關(guān)，通過(guò)氨基酸序列的比較，表明WDV與玉米線條病毒（Maizestreakvirus,MSV），番茄金色花葉病毒（Tomatogoldenmosaicvirus,TGMV）以及木薯潛隱病毒（Cassavalatentvirus,CLV）可能有一個(gè)共同的原始起源（MacDowell等，1985）。圖1.1雙生病毒代表成員基因組結(jié)構(gòu)模式圖(引自Shepherd等，2009)Fig.1.1Genomeorganizationofrepresentativemembersofthefourgeminivirusgenera目前，由小麥矮縮病毒引起、介體異沙葉蟬(PsammotettixstriatusL.)傳播的小麥矮縮病已成為生產(chǎn)上一類重要的病毒病害，可引起植株嚴(yán)重矮化、黃化、條斑及分蘗增多等癥狀，對(duì)小麥產(chǎn)量構(gòu)成嚴(yán)重威脅。目前該病害危害范圍已遍布?xì)W洲大部分地區(qū)，甚至已經(jīng)波及到非洲的突尼斯以及贊比亞等國(guó)家。2007年，小麥矮縮病在我國(guó)陜西韓城北部地區(qū)嚴(yán)重發(fā)生，發(fā)病面積約為7001 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第一章引言公頃，發(fā)病田塊減產(chǎn)50%-80%，而且該病害在我國(guó)有加劇蔓延的趨勢(shì)（王江飛等，2008）。Kumar等從印度小麥矮縮病毒(WheatdwarfIndiavirus,WDIV)病害復(fù)合物中分離出了木爾坦棉花曲葉病毒DNAα衛(wèi)星分子(CottonleafcurlMultanalphasatellite,CLCuMA)、瓜爾豆卷葉病毒DNAα衛(wèi)星分子(Guarleafcurlalphasatellite,GLCuA)以及勝紅薊黃化曲葉病毒DNAβ衛(wèi)星分子(Ageratumyellowleafcurlbetasatellite,AYLCB)，說(shuō)明玉米線條病毒屬病毒存在復(fù)雜致病機(jī)制，也給病毒病防控帶來(lái)潛在的挑戰(zhàn)和困難（Kumar等，2014）。圖1.2小麥矮縮病田間癥狀(劉艷攝于陜西韓城，2011)Fig.1.2Symptomofwheatdwarfdiseaseinthefield（photographedbyLiuYaninHancheng,ShaanxiProvince,2011）1.1.2WDV的復(fù)制及轉(zhuǎn)錄調(diào)控1.1.2.1WDV的復(fù)制玉米線條病毒屬成員具有相似的基因組結(jié)構(gòu)，病毒鏈第一個(gè)ORF和互補(bǔ)鏈第一個(gè)ORF之間存在約300nt的長(zhǎng)基因間隔區(qū)LIR，LIR通常包含位于中部的上游激活序列(upstreamactivatingsequence,UAS)以及位于兩端的雙向啟動(dòng)子序列，LIR序列與基因組復(fù)制和基因轉(zhuǎn)錄密切相關(guān)。UAS通常具有一個(gè)約30nt的發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)（hairpinloop)，它的莖部（Stem）富含GC堿基，環(huán)區(qū)（loop）則富含AT，環(huán)中保守的TAATATTAC序列與病毒復(fù)制起始有關(guān)（圖1.3）。DNA序列分析表明，位于LIR中TATA盒附近通常存在由3-6個(gè)8nt-11nt組成的重復(fù)序列，其對(duì)病毒的復(fù)制十分重要，WDV的復(fù)制除了需要LIR的調(diào)控序列外，短基因間隔區(qū)（SIR）也是復(fù)制所必需的。WDV按照雙生病毒共有的滾環(huán)復(fù)制的方式進(jìn)行病毒基因組的復(fù)制（Hanley-Bowdoin等，1999）。復(fù)制分為兩個(gè)階段：第一步，合成互補(bǔ)鏈。以病毒鏈DNA為模板，在病毒和寄主因子(依賴寄主的DNA合成酶系)作用下合成超螺旋共價(jià)雙鏈閉環(huán)DNA（dsDNA）的中間體，一般認(rèn)為互補(bǔ)鏈的合成完全依賴于寄主因子，而且首先需要一段短的ssDNA或者RNA作為引物。第二步，滾環(huán)復(fù)制的起始。在病毒復(fù)制因子（Rep/RepA,REn等）和寄主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制因子的作用下，以dsDNA復(fù)制中間體作為模板合成的正義鏈從原來(lái)母鏈中游離出來(lái)產(chǎn)生單鏈，合成終止時(shí)被Rep蛋白切割并且鏈接形成環(huán)狀DNA（Laufs等，1995）。2 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第一章引言圖1.3WDV序列中形成的發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)(來(lái)源于http://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb/Servers/Predict1/ResultsPages/1546332741660582267/Results.html的預(yù)測(cè)結(jié)果)Fig.1.3ThehairpinloopstructureofWDV1.1.2.2WDV的轉(zhuǎn)錄調(diào)控雙生病毒dsDNA復(fù)制中間體不僅對(duì)滾環(huán)復(fù)制至關(guān)重要，同時(shí)還可作為模板進(jìn)行病毒基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。病毒的轉(zhuǎn)錄發(fā)生在寄主細(xì)胞核內(nèi)，所需要的RNA聚合酶II系統(tǒng)及一些轉(zhuǎn)錄因子由寄主細(xì)胞提供，病毒基因間隔區(qū)中包含雙向啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子能夠通過(guò)雙向轉(zhuǎn)錄方式產(chǎn)生mRNA（Koonin等，1993）。WDV同雙生病毒科其他成員一樣擁有一套十分復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄過(guò)程，病毒轉(zhuǎn)錄常常會(huì)形成多重重疊的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，以多順?lè)醋訛橹?。不同雙生病毒的轉(zhuǎn)錄策略也有所不同，雙組分雙生病毒的轉(zhuǎn)錄起始于CR或CR的一側(cè)，單組分雙生病毒的轉(zhuǎn)錄起始于IR。雙生病毒基因組的轉(zhuǎn)錄分為早期轉(zhuǎn)錄和晚期轉(zhuǎn)錄兩個(gè)階段，早期轉(zhuǎn)錄階段表達(dá)的是復(fù)制相關(guān)蛋白和轉(zhuǎn)錄激活蛋白以及其它一些由互補(bǔ)鏈編碼的蛋白；晚期轉(zhuǎn)錄階段表達(dá)病毒鏈編碼的外殼蛋白及核穿梭蛋白，促進(jìn)病毒DNA轉(zhuǎn)運(yùn)與裝配。1.2植物病毒誘導(dǎo)癥狀形成的分子機(jī)制1.2.1病毒與寄主植物互作誘發(fā)癥狀形成由于病毒與寄主基因產(chǎn)物會(huì)發(fā)生互作，使得病毒侵染癥狀的發(fā)生成為一個(gè)錯(cuò)綜復(fù)雜的過(guò)程。對(duì)于RNA病毒而言，早期關(guān)于致病相關(guān)基因的研究主要是通過(guò)多組分體病毒的假重組實(shí)驗(yàn)來(lái)完成，將不同病毒的不同RNA組分混合接種，以此來(lái)研究各基因的功能。然而對(duì)于單組份體的DNA病毒來(lái)講，此種方法顯然是行不通的，只能通過(guò)構(gòu)建一系列突變體來(lái)實(shí)現(xiàn)。1.2.1.1植物病毒致病因子目前已經(jīng)得到證實(shí)，煙草花葉病毒屬（Tobamovirus）、雀麥花葉病毒屬（Bromovirus）、香石竹病毒屬（Dianthovirus）等許多病毒的CP與癥狀形成緊密相關(guān)，主要引起褪綠、壞死、局部3 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第一章引言病斑等。病毒編碼的非結(jié)構(gòu)運(yùn)動(dòng)蛋白MP主要介導(dǎo)病毒在寄主的胞間移動(dòng)，也參與癥狀的表現(xiàn)（Rao等，1995;Shintaku等，1992;Tsai等，1993）。還有研究發(fā)現(xiàn)雙生病毒的兩個(gè)復(fù)制酶相關(guān)蛋白（解旋酶Rep及對(duì)復(fù)制起始具有正向調(diào)控作用的順式作用蛋白R(shí)epA）也參與癥狀誘導(dǎo)。此外，復(fù)制酶也可參與病毒的胞間移動(dòng)，構(gòu)建雀麥花葉病毒（Bromemosaicvirus,BMV）的2a復(fù)制酶基因一系列缺失和移碼突變體時(shí)發(fā)現(xiàn)，所有突變體在大麥植株上都不能造成系統(tǒng)侵染，但某些突變體可在大麥原生質(zhì)體內(nèi)正常復(fù)制，卻抑制了BMV在胞間運(yùn)動(dòng)的能力（Traynor等，1991）。病毒常常伴隨一些衛(wèi)星分子，它們往往會(huì)影響病毒癥狀的發(fā)生程度。不同的衛(wèi)星分子調(diào)節(jié)癥狀形成的能力不同，主要效果有加重癥狀、減輕癥狀或者無(wú)明顯調(diào)節(jié)作用，這取決于寄主、衛(wèi)星分子以及輔助病毒三者之間的相互關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，黃瓜花葉病毒（Cucumbermosaicvirus,CMV）的衛(wèi)星RNA有許多種株系,不同的株系對(duì)癥狀的調(diào)節(jié)作用有很大差別，用不同株系的衛(wèi)星RNA與一種病毒組合接種番茄，會(huì)出現(xiàn)壞死、白化以及輕微顯癥三種不同的癥狀表現(xiàn)類型（Takanami，1981）。雙生病毒也常常伴隨有衛(wèi)星DNA的存在，如雙生病毒科菜豆金色花葉病毒屬病毒伴隨著一種新型衛(wèi)星分子DNAβ，DNAβ分子與病毒的致病性有密切關(guān)系，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，DNAβ上有一個(gè)位置保守的編碼區(qū)，編碼118個(gè)氨基酸的βC1蛋白，突變分析發(fā)現(xiàn)βC1蛋白是一個(gè)癥狀決定因子，βC1的啟動(dòng)子對(duì)癥狀誘導(dǎo)也會(huì)產(chǎn)生影響，miRNA芯片分析以及Northernblot實(shí)驗(yàn)表明βC1可能是通過(guò)某種機(jī)制降低miRNA的表達(dá)量，進(jìn)而影響植物正常的生理活動(dòng)（Ding等，2009;Zhou等，2003）。關(guān)于衛(wèi)星分子減輕病毒誘導(dǎo)的癥狀，可能原因是它們與輔助病毒或者病毒爭(zhēng)奪復(fù)制酶，從而抑制了病毒的復(fù)制進(jìn)程。1.2.1.2植物病毒侵染對(duì)寄主代謝途徑的影響病毒要在寄主上建立侵染，必須經(jīng)過(guò)至少三個(gè)過(guò)程，即基因復(fù)制、胞間移動(dòng)以及依賴于維管束系統(tǒng)的長(zhǎng)距離運(yùn)輸，每一過(guò)程都是病毒與寄主植物互作的結(jié)果。抗病品種與感病品種對(duì)病毒致病因子的親和力決定了病毒與寄主植物互作的結(jié)果，也成為最終癥狀產(chǎn)生與否的關(guān)鍵因素。植物病毒的侵染會(huì)對(duì)植物體內(nèi)多種的生理活動(dòng)產(chǎn)生深刻的影響，涉及到光合作用、植物防衛(wèi)反應(yīng)、物質(zhì)代謝、能量傳遞等等。（1）病毒侵染對(duì)植物光合系統(tǒng)的影響。Rahoutei等研究了辣椒輕斑駁病毒不同株系：Peppermildmottleviruses（PMMoV）和Paprikamildmottleviruses（PaMMoV）侵染之后本氏煙光合系統(tǒng)發(fā)生的變化，結(jié)果顯示，在所有顯癥和未顯癥的葉片上，光系統(tǒng)II的電子傳遞都受到了抑制，類囊體膜上放氧復(fù)合體中的24kDa和16kDa的外蛋白相比健康植株中含量有所下降。另外，病毒CP可以結(jié)合到葉綠體以及類囊體膜上，在感染病毒植株中葉綠素含量也下降（Rahoutei等，2000）。Gon?alves等以甘蔗黃葉病毒（Sugarcaneyellowleafvirus,SYLV）侵染后的甘蔗為研究對(duì)象，測(cè)定了葉片上的葉綠素a的熒光值以及氣體交換率，并與光合色素以及碳水化合物的含量做了關(guān)聯(lián)分析，受病毒侵染的葉片與健康對(duì)照相比較光合系統(tǒng)發(fā)生的變化有：光系統(tǒng)II的潛在量子效率下降、質(zhì)體醌池的填充過(guò)程異常，CO2交換率降低，光合色素總量以及葉綠素a與葉綠素b的比值均有所下降（Gon?alves等，2005）。（2）病毒侵染對(duì)植物激素代謝的影響。植物體內(nèi)各種激素的穩(wěn)態(tài)平衡是植物正常生長(zhǎng)發(fā)育的前提條件，植物在遭受到來(lái)自生物因素或非生物因素帶來(lái)的脅迫時(shí)，便可能無(wú)法維持各激素之間的代謝平衡，導(dǎo)致代謝紊亂以及各種病變的發(fā)生。植物病毒侵染寄主植物后，通常表現(xiàn)出花葉、4 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第一章引言褪綠、矮化、畸變等癥狀，嚴(yán)重影響其產(chǎn)量和品質(zhì)。了解病毒侵染植物導(dǎo)致的內(nèi)源激素的變化情況，有助于解析植物病毒的致病機(jī)制，進(jìn)而為生產(chǎn)上有針對(duì)性地防治病毒病害提供理論依據(jù)。除了生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素、赤霉素、脫落酸、乙烯之外，油菜素甾醇、多胺、茉莉酸、水楊酸等新型植物激素也日益受到重視。為了同時(shí)了解生物壓力與非生物壓力對(duì)擬南芥生長(zhǎng)發(fā)育的影響，Vitti等將生長(zhǎng)2周的擬南芥幼苗分別用10μMCdSO4處理以及感染CMV，12天后與健康對(duì)照相比，結(jié)果表明兩種壓力脅迫下的幼苗均出現(xiàn)根毛增長(zhǎng)、側(cè)根增多的現(xiàn)象。激素含量測(cè)定顯示在根中生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素的比值顯著升高，兩種脅迫下植物的表現(xiàn)相似（Vitti等，2013）。Gaudinova等測(cè)定了黑醋栗逆轉(zhuǎn)病毒（Blackcurrantreversionvirus,BRV）侵染下，白醋栗和紅醋栗花發(fā)育過(guò)程中激素含量的變化情況，結(jié)果顯示，在花發(fā)育初期兩個(gè)品種中的具有生物活性的細(xì)胞分裂素及細(xì)胞分裂素前體均有所提高。在花器官向漿果轉(zhuǎn)變的過(guò)程中，健康植株中伴隨著細(xì)胞分裂素含量明顯升高的現(xiàn)象，然而感染病毒的花中未觀察到這種變化，這導(dǎo)致花器官不能進(jìn)一步發(fā)育。在葉片中，病毒的侵染對(duì)生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的含量的影響不顯著，而花中的脫落酸含量則略有上升（Gaudinova等，2008）。此外，早期的研究表明番茄不孕病毒（Tomatoaspermyvirus,ToAV）侵染番茄、煙草花葉病毒（Tobaccomosaicvirus,TMV）侵染煙草、黃瓜花葉病毒CMV侵染黃瓜、水稻東格魯病毒（Ricetungrobacillifromvirus,RTBV）侵染水稻，馬鈴薯紡錘塊莖類病毒（Potatospindletuberviroid,PSTVd）侵染馬鈴薯，大麥黃矮病毒（Barleyyellowdwarfvirus,BYDV）侵染大麥均導(dǎo)致寄主植物體內(nèi)赤霉素含量降低，而被侵染植株通常也表現(xiàn)出脫落酸和乙烯含量的上升（Whenham，1982）。1.2.2miRNA等與病毒癥狀形成的關(guān)系miRNA是一類非編碼RNA，曾經(jīng)一度被科學(xué)界認(rèn)為是無(wú)用的“垃圾RNA”，但隨著近年來(lái)研究的不斷深入，研究者發(fā)現(xiàn)非編碼miRNA事實(shí)上在細(xì)胞功能中發(fā)揮著重要的作用，miRNA在植物體內(nèi)參與多種多樣的調(diào)節(jié)途徑，包括生長(zhǎng)發(fā)育、蛋白降解、細(xì)胞增殖和凋亡、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、環(huán)境脅迫及病原入侵等等。研究表明，miRNA調(diào)控許多重要基因的表達(dá)，而且多數(shù)都是轉(zhuǎn)錄因子（Zhang等，2006）。近年來(lái)，miRNAs的鑒定和定性研究已成為迅速發(fā)展的一大熱點(diǎn)領(lǐng)域。1.2.2.1植物體內(nèi)miRNA產(chǎn)生和作用機(jī)理在真核生物體內(nèi)，首先轉(zhuǎn)錄出較長(zhǎng)的初級(jí)miRNA（primarymiRNA,pri-miRNA），然后在核內(nèi)由RNaseIII樣酶Drosha或Pasha加工成60-70個(gè)核苷酸的發(fā)夾狀RNA，即前體miRNA（miRNAprecusor,pre-miRNA），在Exprotin-5復(fù)合物的幫助下被轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞核，在細(xì)胞質(zhì)中由Dicer剪切成為成熟miRNA，隨即被整合進(jìn)RNA沉默復(fù)合物（RISC）中，形成miRNP(核蛋白復(fù)合體)。在RISC的作用下miRNA與靶基因的3'-UTR區(qū)互補(bǔ)配對(duì)，對(duì)靶基因進(jìn)行切割或者是翻譯抑制（Jung等，2009），究竟起何作用取決于miRNA與靶基因的互補(bǔ)程度，完全互補(bǔ)時(shí)對(duì)靶基因進(jìn)行切割；不完全互補(bǔ)時(shí)對(duì)靶基因進(jìn)行翻譯抑制。在植物體內(nèi)，miRNA與靶基因多數(shù)都是完全互補(bǔ)的。5 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第一章引言圖2.2植物體內(nèi)miRNA產(chǎn)生及作用機(jī)制Fig.2.2ModelformiRNAbiogenesisandactivityinplants（Kidner等，2005）1.2.2.2逆境脅迫下植物miRNA的應(yīng)答機(jī)制植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，不可避免地會(huì)遭受來(lái)自不良環(huán)境的非生物脅迫以及來(lái)自病蟲(chóng)害的生物脅迫，植物在對(duì)抗各種壓力的過(guò)程中逐漸進(jìn)化形成了一套防御機(jī)制，其中miRNA的調(diào)節(jié)和響應(yīng)是植物面對(duì)逆境脅迫的重要途徑，研究表明一種miRNA可能對(duì)多種脅迫做出響應(yīng)（Chen，2005）。植物受到逆境脅迫之后，最終的結(jié)果是引起植物代謝途徑發(fā)生改變，此時(shí)植物會(huì)啟動(dòng)包括轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平和翻譯水平上的調(diào)控，這是對(duì)外界刺激做出的適應(yīng)性反應(yīng)。miRNA調(diào)控方式通常是轉(zhuǎn)錄后水平上的，miRNA可以調(diào)控許多轉(zhuǎn)錄因子，然后通過(guò)改變轉(zhuǎn)錄因子的活性進(jìn)而調(diào)控靶基因的表達(dá)。Guo等發(fā)現(xiàn)在擬南芥中miR164可以直接導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子NAC1的mRNA降解，抑制生長(zhǎng)素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而影響擬南芥?zhèn)雀陌l(fā)育（Guo等，2005）。（1）非生物脅迫下miRNA的響應(yīng)機(jī)制。非生物脅迫主要來(lái)自干旱、營(yíng)養(yǎng)缺乏、凍害、重金屬、高鹽等，Jones-Rhoades等利用比較基因組學(xué)的方法從擬南芥中篩選出了92個(gè)miRNA，靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，這些miRNA除了參與植物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控之外，還有一些參與超氧化物歧化酶、漆酶和ATP硫酸化酶等基因的調(diào)控，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明“硫饑餓”誘導(dǎo)處理后，靶標(biāo)基因?yàn)榱蛩峄傅膍iR395表達(dá)上調(diào)（Jones-Rhoades等，2004）。（2）生物脅迫下miRNA的響應(yīng)機(jī)制。植物遭受的生物脅迫主要來(lái)自于害蟲(chóng)取食以及細(xì)菌、真菌、病毒等病原物的侵染，這類因素會(huì)誘導(dǎo)植物中miRNA參與的抗病反應(yīng)的啟動(dòng)和響應(yīng)。6 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第一章引言Navarro等的研究表明來(lái)源于細(xì)菌鞭毛蛋白的肽段可以誘導(dǎo)擬南芥產(chǎn)生特定的miRNA，這種miRNA對(duì)F-box生長(zhǎng)素受體TIR1、AFB2和AFB3起負(fù)調(diào)節(jié)作用，抑制生長(zhǎng)素信號(hào)傳遞可以限制細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌P.Syringae的生長(zhǎng)（Navarro等，2006）。Sun等構(gòu)建了水稻葉片和根的4個(gè)小RNA文庫(kù)和和4個(gè)降解組文庫(kù)，利用小RNA與降解組測(cè)序技術(shù)比較了健康水稻和受到水稻黑條矮縮病毒（Riceblackstreakeddwarfvirus,RBSDV）侵染的水稻體內(nèi)miRNA的表達(dá)差異。分析結(jié)果表明，在葉片和根中分別有14個(gè)和16個(gè)miRNA顯著差異表達(dá)，并且對(duì)病毒侵染響應(yīng)的17個(gè)保守和16個(gè)非保守miRNA的靶基因進(jìn)行了預(yù)測(cè)，該研究對(duì)于闡明病毒侵染條件下水稻不同組織miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)具有重要意義（Sun等，2014）。1.2.2.3病毒來(lái)源的小RNA在致病過(guò)程中的作用植物病毒侵染后可以誘導(dǎo)寄主發(fā)生基因沉默現(xiàn)象，這一過(guò)程中許多病毒來(lái)源的小RNA起到了重要作用。Bouche等構(gòu)建了4個(gè)不同的擬南芥Dicer酶突變體，用于研究Dicer酶不同功能域在切割產(chǎn)生小RNA方面的影響，結(jié)果顯示，DCL1蛋白同時(shí)具有切割產(chǎn)生miRNA與siRNA的能力，而其他三個(gè)DCL蛋白只能產(chǎn)生siRNA。病毒dsRNA或ssRNA中某些結(jié)構(gòu)化的區(qū)域可被不同的Dicer酶加工成為特定大小的小RNA，DCL2和DCL4在產(chǎn)生正鏈RNA病毒來(lái)源的小RNA時(shí)發(fā)揮主要作用（Bouche等，2006）。研究表明，來(lái)源于病毒的小RNA可以通過(guò)調(diào)控寄主靶基因的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)病毒癥狀的形成。Smith等發(fā)現(xiàn)了CMV的Y衛(wèi)星RNA(Y-Sat)能誘導(dǎo)煙草葉片產(chǎn)生黃化癥狀的分子證據(jù)，研究得出的結(jié)論是參與葉綠素合成的基因CHLI序列與CMV的Y衛(wèi)星RNA(Y-Sat)存在一個(gè)22核苷酸的互補(bǔ)區(qū)域，而且在Y-Sat侵染的植物中，CHLI基因表達(dá)顯著下調(diào)。小RNA測(cè)序以及5′-RACE實(shí)驗(yàn)證明，Y-Sat來(lái)源的siRNAs可以剪切CHLI的mRNA，從而影響葉綠素的合成。構(gòu)建RNAi干涉載體沉默CHLI基因的表達(dá)，煙草出現(xiàn)了類似于Y-Sat侵染誘導(dǎo)的癥狀（Smith等，2011）。病毒來(lái)源的miRNA主要的功能存在于以下幾個(gè)方面：首先，在病毒侵染的潛伏期，病毒僅表達(dá)維持其在細(xì)胞中存在所需要最小量的病毒基因，來(lái)逃避宿主的抗病毒反應(yīng)。第二，調(diào)控寄主被侵染細(xì)胞的程序性死亡，以利于病毒的大量復(fù)制和擴(kuò)增。第三，病毒的侵染過(guò)程中，調(diào)節(jié)自身基因或宿主基因的表達(dá)。病毒來(lái)源的miRNA與寄主miRNA之間的相互作用形成了錯(cuò)綜復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。病毒miRNA與宿主miRNA共同調(diào)節(jié)宿主基因的表達(dá)，二者也共同調(diào)節(jié)病毒的基因表達(dá)。研究病毒編碼miRNA與宿主miRNA的關(guān)系可為動(dòng)物和人類病毒病的治療提供新的思路，在植物中，也有助于闡明病毒致病的分子機(jī)制，為制定抗病毒策略提供理論依據(jù)（趙樸等，2007）。1.3高通量測(cè)序技術(shù)及侵染性克隆在植物與病毒研究中的應(yīng)用1.3.1高通量測(cè)序技術(shù)在研究植物與病毒及其互作關(guān)系中的應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)（High-throughputsequencing）或“下一代”測(cè)序技術(shù)（Next-generationsequencingtechnology），是對(duì)以Sanger法（雙脫氧鏈終止法）為代表的第一代測(cè)序技術(shù)的突破性變革。近年來(lái)，高通量測(cè)序技術(shù)以其高通量、高效率、高準(zhǔn)確性和低成本等方面的突出優(yōu)勢(shì)，被廣泛應(yīng)用于全基因組測(cè)序、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和SmallRNA測(cè)序等方面的研究，推動(dòng)了農(nóng)業(yè)科學(xué)諸多領(lǐng)域的快速發(fā)展，如糧食作物及經(jīng)濟(jì)作物抗性基因的篩選、作物分子育種、動(dòng)植物病原物致病分子機(jī)制、植物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控機(jī)理等。與此同時(shí)，高通量測(cè)序技術(shù)的日臻成熟和廣泛應(yīng)用正在引領(lǐng)7 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第一章引言眾多新興學(xué)科如計(jì)算生物學(xué)、功能基因組學(xué)、比較基因組學(xué)、生物信息學(xué)、表觀遺傳學(xué)、生物數(shù)學(xué)等進(jìn)入一個(gè)前所未有的技術(shù)層面和發(fā)展高度?？茖W(xué)的發(fā)展使得研究者對(duì)測(cè)序工作的需求日益擴(kuò)大，因此眾多高通量測(cè)序平臺(tái)應(yīng)運(yùn)而生。Roche的454焦磷酸測(cè)序技術(shù)、Illumina/Solexa的邊合成邊測(cè)序技術(shù)、以及ABI/SOLiD的基于連接酶的測(cè)序技術(shù)成為了其中的典型代表（Margulies等，2005;Shaffer，2007;Shendure等，2008）。（1）在植物研究中的應(yīng)用。首先，植物全基因組測(cè)序中將高通量測(cè)序技術(shù)與傳統(tǒng)測(cè)序方法相結(jié)合的策略，給遺傳背景不清物種的測(cè)序帶來(lái)了極大的便利，蘋(píng)果、玉米等非模式物種的全基因組測(cè)序工作都是在高通量測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用下才得以在短時(shí)間內(nèi)順利完成（Sato等，2011;Schnable等，2009;Velasco等，2010）。植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中生理活動(dòng)的自我調(diào)節(jié)甚至受到不良刺激時(shí)代謝通路發(fā)生異常，本質(zhì)上都是基因表達(dá)模式發(fā)生改變的結(jié)果，而轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是植物體內(nèi)基因表達(dá)調(diào)控中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。RNA-Seq深度測(cè)序技術(shù)因能全面地揭示生物在特定時(shí)間和特定組織的基因表達(dá)情況而被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)錄組的研究（Barakat等，2009;Dassanayake等，2009）。運(yùn)用RNA-Seq可以在植物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄本、檢測(cè)各個(gè)基因表達(dá)量、挖掘單核苷酸多態(tài)性(SNPs)、簡(jiǎn)單重復(fù)序列多態(tài)性（SSRs）以及可變剪接等等。異源六倍體小麥龐大而復(fù)雜的基因組使得其測(cè)序工作變得十分困難，Yu等利用高通量測(cè)序技術(shù)（RNA-Seq）獲得了許多小麥和水稻SSR多態(tài)性位點(diǎn)，對(duì)二者同源性位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)發(fā)現(xiàn)44%的SSR為二者共有，這在一定程度上說(shuō)明水稻和小麥的基因具有相當(dāng)程度的同源性（Yu等，2004）。Zenoni等運(yùn)用RNA-Seq測(cè)定了葡萄在轉(zhuǎn)錄水平基因表達(dá)情況，共檢測(cè)了17324個(gè)基因，在尋找與果實(shí)發(fā)育過(guò)程相關(guān)基因時(shí)，發(fā)現(xiàn)有6695個(gè)基因具有階段表達(dá)特異性，385個(gè)基因具有可變剪接現(xiàn)象。除此之外，還發(fā)現(xiàn)了53個(gè)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶蛋白家族和28個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子新基因（Zenoni等，2010）。Li等利用Illumina測(cè)序?qū)τ衩兹~片不同發(fā)育階段以及不同組織的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了測(cè)序，數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明，不同發(fā)育階段的葉片之間有64%的基因差異表達(dá)，而在維管束鞘和葉肉細(xì)胞之間有21%的基因差異表達(dá)，還利用基因組可視化工具Gbrowse觀察了基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化，即由葉基部初生細(xì)胞壁和細(xì)胞內(nèi)基礎(chǔ)代謝向葉尖內(nèi)次生細(xì)胞壁以及C4光合系統(tǒng)發(fā)育的過(guò)渡過(guò)程（Li等，2010）。miRNA作為一類重要的負(fù)調(diào)控因子，越來(lái)越受到重視，然而由于miRNA在植物體內(nèi)分布廣泛、數(shù)量龐大、種類繁多，而且某些miRNA在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)豐度特別低，因此傳統(tǒng)的測(cè)序方法已經(jīng)無(wú)法滿足研究的需要。運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)不但能夠檢測(cè)到植物體內(nèi)低表達(dá)的miRNA，而且在有物種參考基因組的情況下，還能挖掘出新的miRNA，這極大地加快了miRNA的研究進(jìn)展（Sunkar等，2008）。Gebelin等利用Solexa測(cè)序技術(shù)對(duì)嚴(yán)重非生物脅迫下橡膠體內(nèi)的miRNA表達(dá)情況進(jìn)行了分析，結(jié)果鑒定了48個(gè)在其他物種中也同樣保守的miRNA家族，發(fā)現(xiàn)了10個(gè)新的miRNA家族成員。所有的miRNA長(zhǎng)度分布于20-22個(gè)核苷酸和23-27個(gè)核苷酸兩個(gè)區(qū)段，這兩類miRNA各自行使不同的功能。此外，還對(duì)miRNA的靶標(biāo)基因進(jìn)行了預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示靶基因主要功能為對(duì)刺激做出的反應(yīng)、抗氧化、轉(zhuǎn)錄活性等（Gebelin等，2012）。研究植物在病蟲(chóng)害侵染等生物脅迫下體內(nèi)miRNA的調(diào)控，有利于發(fā)現(xiàn)寄主新的抗性機(jī)制，從而篩選出抗性基因。Yin等對(duì)健康和受大豆花葉病毒（Soybeanmosaicvirus,SMV）侵染的大豆體內(nèi)miRNA進(jìn)行了測(cè)序分析，共獲得了52個(gè)家族的179個(gè)miRNA，其中5個(gè)新的miRNA被鑒8 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第一章引言定出來(lái)。所有的miRNA指向346個(gè)潛在的靶標(biāo)基因，利用5'-RACE對(duì)其中的12個(gè)靶基因進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果顯示，miR160、miR393以及miR1510三個(gè)miRNA參與了大豆抵抗SMV防衛(wèi)反應(yīng)的調(diào)控（Yin等，2013）。（2）在植物病毒研究中的應(yīng)用。在高通量測(cè)序技術(shù)應(yīng)用之前，只能通過(guò)病毒分離、光學(xué)和電子顯微鏡技術(shù)、分子診斷等對(duì)已知的病毒進(jìn)行檢測(cè)或發(fā)現(xiàn)新病毒。分子診斷技術(shù)中基于PCR的方法有序列非依賴性單引物擴(kuò)增(SISPA)、滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)等，PCR與分子雜交相結(jié)合的方法，如代表性差異分析技術(shù)(RDA)、抑制消減雜交技術(shù)(SSH)等，這些技術(shù)在未知病毒的發(fā)現(xiàn)中得到了廣泛的應(yīng)用。高通量測(cè)序技術(shù)在新病毒資源發(fā)掘中的優(yōu)勢(shì)在于，可以在短時(shí)間內(nèi)對(duì)大量樣本中的未知序列進(jìn)行通量分析，檢測(cè)出所有的DNA病毒、RNA病毒、環(huán)狀RNA分子、類病毒等。目前，將高通量測(cè)序技術(shù)與PCR及分子雜交相結(jié)合的方法來(lái)尋找新病毒，已經(jīng)成為科學(xué)研究上的熱點(diǎn)。Adams等將開(kāi)花植物蛇鞭菊上分離出的一個(gè)未知病原通過(guò)摩擦接種傳播到千日紅上，對(duì)感染的千日紅cDNA做消減雜交后進(jìn)行高通量測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了一個(gè)黃瓜花葉病毒屬的新成員蛇鞭菊輕斑駁病毒（Gayfeathermildmottlevirus,GMMV）（Adams等，2009）。Zhang等利用RNA-Seq測(cè)序技術(shù)，結(jié)合改進(jìn)的生物信息學(xué)分析軟件FFOR，在蘋(píng)果與葡萄中分別發(fā)現(xiàn)了兩種新的環(huán)狀小RNA：Applehammerheadviroid-likeRNA（AHVd-likeRNA）和Grapevinelatentviroid（GLVd），并驗(yàn)證了它們的核酶活性和自我復(fù)制特性，這是首次從蘋(píng)果中發(fā)現(xiàn)了具有核酶活性的環(huán)狀RNA（Zhang等，2014）。高通量測(cè)序技術(shù)還被應(yīng)用于雙生病毒的檢測(cè)以及新病毒發(fā)現(xiàn)。Hagen等將滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)技術(shù)及454焦磷酸測(cè)序技術(shù)相結(jié)合，對(duì)來(lái)自墨西哥的辣椒和印度的番茄田間樣品進(jìn)行了檢測(cè),結(jié)果表明在辣椒上存在辣椒金色花葉病毒、瓦斯特科辣椒黃脈病毒以及番茄金色斑駁病毒三個(gè)雙組分的雙生病毒，在番茄上存在云南賽葵黃脈病毒、煙草曲莖病毒、番茄黃曲葉病毒等26個(gè)雙生病毒及伴隨的衛(wèi)星分子（Hagen等，2012）。2007年，Schubert等利用雙生病毒環(huán)狀DNA基因組的特點(diǎn)，結(jié)合滾環(huán)擴(kuò)增（RCA）、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）以及直接測(cè)序法，從來(lái)自德國(guó)的病毒分離物中發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)雙生病毒新種：大麥矮縮病毒（Barleydwarfvirus,BDV）和燕麥矮縮病毒（Oatdwarfviru,ODV）。Wyant等用類似的方法并結(jié)合焦磷酸測(cè)序技術(shù)對(duì)來(lái)自亞洲、南美及中美的61份植物樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示獲得的83條序列是雙生病毒組分，4條序列來(lái)自于DNA衛(wèi)星分子，隨后的實(shí)驗(yàn)證明利用該方法對(duì)巴西菜豆金色花葉病毒屬病毒的檢測(cè)也是十分經(jīng)濟(jì)有效的。最近，Jeske等從古巴雙生病毒分離物中發(fā)現(xiàn)了許多新株系、一個(gè)命名為“Peristrophemosaicvirus”病毒新種以及一個(gè)與矮縮病毒屬關(guān)系較近的α衛(wèi)星分子（Jeske等，2014;Schubert等，2007;Wyant等，2012）。（3）在植物與病毒互作研究中的應(yīng)用。前文已經(jīng)提及植物病毒誘導(dǎo)癥狀的形成是病毒與寄主在細(xì)胞和超細(xì)胞水平上互作的結(jié)果，病毒的致病因子與植物某些蛋白因子相互作用，從而改變寄主植物基因的表達(dá)模式，影響代謝通路的正常運(yùn)行。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的策略可以獲得由于病毒侵染導(dǎo)致的植物轉(zhuǎn)錄譜的變化情況，病毒致病因子可以與代謝途徑的關(guān)鍵點(diǎn)直接互作，或者通過(guò)結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子來(lái)間接影響基因的正常表達(dá)。因此，通過(guò)對(duì)病毒侵染下轉(zhuǎn)錄組差異基因表達(dá)分析，可以使研究者全面地理解植物與病毒之間的互作，有利于揭示病毒的致病機(jī)理以及寄主植物的抗病分子機(jī)制。Rubio等運(yùn)用RNA-Seq深度測(cè)序技術(shù)對(duì)李痘病毒（Plumpoxvirus,PPV）侵染以后顯癥和無(wú)9 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第一章引言癥階段桃樹(shù)葉片之間的基因表達(dá)差異進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)359個(gè)基因具有可變剪接現(xiàn)象，12290個(gè)單核苷酸多態(tài)性SNP，425個(gè)基因具有注釋信息。GO功能注釋結(jié)果表明，未顯癥和顯癥階段大量的差異表達(dá)基因主要是對(duì)生物刺激做出響應(yīng)、脂類和碳水化合物的代謝以及催化活性的負(fù)調(diào)控等。病毒早期侵染的建立與寄主病原抗性基因的誘導(dǎo)有關(guān)，這些抗病原基因主要有茉莉酸、幾丁質(zhì)酶、細(xì)胞分裂素葡糖基轉(zhuǎn)移酶等。研究還表明，病毒積累之后，過(guò)表達(dá)Dicer2a基因之后病毒HCPro和P1蛋白會(huì)抑制植物基因沉默途徑的發(fā)生。從植物基因表達(dá)的變化可以發(fā)現(xiàn)病毒癥狀的誘導(dǎo)是一個(gè)錯(cuò)綜復(fù)雜的過(guò)程（Rubio等，2015）。Fan等研究發(fā)現(xiàn)甜菜壞死黃脈病毒(Beetnecroticyellowveinvirus,BNYVV)RNA4編碼的p31蛋白是癥狀誘導(dǎo)因子。運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)含RNA4和不含RNA4的病毒侵染本氏煙后葉片組織轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序，與健康對(duì)照組比較后，鑒定出的3016個(gè)差異表達(dá)基因涉及到的代謝途徑主要有基因沉默、泛素化、植物激素代謝等。體外噴施赤霉素矮化癥狀消失，說(shuō)明病毒侵染本氏煙導(dǎo)致矮化癥狀可能是寄主體內(nèi)赤霉素的積累受阻以及細(xì)胞壁合成相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)共同作用的結(jié)果（Fan等，2014）。通過(guò)抗病品種和感病品種在病毒侵染下轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)差異，可以挖掘植物的抗病基因，為植物抗病分子育種提供依據(jù)。Chen等通過(guò)全基因組測(cè)序?qū)Ψ腰S化曲葉病毒(Tomatoyellowleafcurlvirus,TYLCV)侵染條件下抗感病品種在病毒脅迫下基因表達(dá)的差異變化進(jìn)行了比較分析。結(jié)果共得到了34831個(gè)unigene，在抗病品種中有209個(gè)基因差異表達(dá)而感病品種中809個(gè)基因差異表達(dá)。在抗病品種有58.37%的基因上調(diào)表達(dá)，遠(yuǎn)高于感病品種中9.17%的比例。WRKY轉(zhuǎn)錄因子、R基因、蛋白激酶等在感病品種中下調(diào)表達(dá)，而在抗病品種中上調(diào)表達(dá)或無(wú)顯著變化，這有利于針對(duì)病毒尋找到抗病基因（Chen等，2013）。1.3.2侵染性克隆在病毒研究中的應(yīng)用所謂侵染性克隆是指，病毒具有侵染性的cDNA或DNA，或者是它們具有侵染性的體外轉(zhuǎn)錄物。上世紀(jì)70年代DNA重組技術(shù)的出現(xiàn)使得病毒工作者可以將RNA病毒的基因組轉(zhuǎn)化為互補(bǔ)的cDNA拷貝，然后插入到細(xì)菌質(zhì)粒中進(jìn)行復(fù)制，這使得研究者能夠?qū)蚪M相對(duì)較小的病毒或基因組為多分體的病毒進(jìn)行反向遺傳學(xué)操作。侵染性克隆技術(shù)的推廣與應(yīng)用，推動(dòng)了病毒研究相關(guān)工作以及病毒學(xué)的向前發(fā)展。1.3.2.1侵染性克隆概述為了使插入載體的克隆序列高效表達(dá)，后來(lái)的改進(jìn)措施是在插入片段上游的載體中加上啟動(dòng)子。若是構(gòu)建具有侵染性的DNA或cDNA克隆載體，則通常用的是花椰菜花葉病毒（Cauliflowermosaicvirus,CaMV）35S啟動(dòng)子；若是利用它們產(chǎn)生具有侵染性的體外轉(zhuǎn)錄物，則需要加入的是T7、SP6等啟動(dòng)原核表達(dá)的啟動(dòng)子。這就是現(xiàn)在使用最廣泛的侵染性克隆構(gòu)建策略。實(shí)際上最早用于制備侵染性克隆的是DNA病毒，如雙生病毒的DNA本身就是侵染性克隆，然而DNA病毒的復(fù)制能力不及RNA病毒，另一個(gè)限制其應(yīng)用的是DNA病毒易發(fā)生同源重組（Hefferon等，2003）。1982年，植物DNA病毒的侵染性克隆首次在番茄金色花葉病毒（Tomatogoldenmosaicvirus,TGMV)中構(gòu)建成功（Bisaro等，1982）。構(gòu)建雙生病毒的侵染性克隆時(shí)要將1.2-2.0個(gè)串聯(lián)重復(fù)的全長(zhǎng)基因組插入到一個(gè)雙元轉(zhuǎn)化載體中，才能保證其復(fù)制和侵染的完整性。10 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第一章引言目前這種方法已在多種玉米線條病毒屬病毒中得到應(yīng)用，如玉米線條病毒MSV、煙草黃矮病毒（Tobaccoyellowdwarfvirus,TobYDV）和菜豆黃矮病毒（Beanyellowdwarfvirus,BeYDV）。R.J.HAYES及Woolston,C.J.等早在1988年就嘗試構(gòu)建小麥矮縮病毒侵染性克隆，但并未觀察到植株出現(xiàn)典型的癥狀表現(xiàn)，Ramsell等構(gòu)建了小麥矮縮病毒大麥株系侵染性克隆用于研究其寄主范圍，其研究結(jié)果表明改進(jìn)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的固體菌落針刺法適用于多種禾本科植物的侵染性克隆接種（Ramsell等，2009）。對(duì)于不能機(jī)械傳播的病毒，其侵染性克隆的構(gòu)建為進(jìn)一步研究病毒基因組結(jié)構(gòu)、功能和表達(dá)調(diào)控機(jī)制提供了可能。由于小麥矮縮病毒由異沙葉蟬?；詡鞑?，不能通過(guò)機(jī)械摩擦接種傳毒，使得致病性研究有一定的困難。實(shí)驗(yàn)表明玉米線條病毒屬病毒均不能通過(guò)機(jī)械摩擦接種，一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的侵染性克隆接種技術(shù)被發(fā)展起來(lái)用于此類病毒的接種。1.3.2.2侵染性克隆用于研究病毒致病機(jī)理病毒侵染性克隆構(gòu)建成功以后，可以對(duì)載體上的病毒序列進(jìn)行插入突變、置換突變、基因敲除等操作，通過(guò)建立一系列高效穩(wěn)定的突變體和重組體侵染性克隆，從而明確致病相關(guān)基因的功能以及致病因子的關(guān)鍵功能域或關(guān)鍵氨基酸等。有些病毒的致病因子若某一個(gè)關(guān)鍵氨基酸發(fā)生突變，即可導(dǎo)致功能完全喪失。Wu等研究發(fā)現(xiàn)小西葫蘆黃花葉病毒（Zucchiniyellowmosaicvirus,ZYMV）的多功能蛋白HC-Pro具有三個(gè)與致病力相關(guān)的氨基酸位點(diǎn)，分別為180位Arg、205位Phe和396位Glu。若180位Arg和396位Glu兩個(gè)位點(diǎn)發(fā)生突變，則病毒突變體致病力會(huì)明顯下降，在寄主上只會(huì)誘導(dǎo)輕微的褪綠斑點(diǎn)且后期癥狀消失，如果180位Arg和205位Phe兩個(gè)位點(diǎn)同時(shí)突變，則會(huì)完全喪失致病力（Wu等，2010）。1.3.2.3侵染性克隆作為外源基因表達(dá)載體或VIGS載體基于植物病毒載體表達(dá)外源基因的簡(jiǎn)便性與高效性，可以利用其作為生產(chǎn)某些重要疫苗、抗體等的工具，這樣大大減少了成本，具有良好的發(fā)展前景和很高的商業(yè)價(jià)值。應(yīng)用最廣泛的病毒表達(dá)載體是PVX，Sablowski等利用PVX作為表達(dá)載體成功地將花器官中特異的MYB轉(zhuǎn)錄因子在葉片中實(shí)現(xiàn)了異位表達(dá)（Sablowski等，1995）。Liu等將能產(chǎn)生反義RNA的核酸序列重組到PVX載體上，該重組載體成功表達(dá)具有錘頭型的核酶，該核酶的表達(dá)能使受到李痘病毒侵染的克氏煙上的癥狀延遲3-5天出現(xiàn)（Liu等，2000）。除此之外，一些外源無(wú)毒基因、糖蛋白之類的物質(zhì)都在PVX上成功實(shí)現(xiàn)了表達(dá)。構(gòu)建病毒誘導(dǎo)的基因沉默表達(dá)載體也是植物侵染性克隆的一個(gè)重要用途，將攜帶有侵染性克隆的植物表達(dá)載體經(jīng)過(guò)適當(dāng)改造后即可成為VIGS載體，將植物的未知目標(biāo)基因構(gòu)建到VIGS載體上，攜帶目標(biāo)基因的病毒侵染后便會(huì)誘導(dǎo)植物內(nèi)源基因沉默，引起表型變化，這已經(jīng)成為目前研究植物基因功能十分有效的工具。大麥條紋花葉病毒（Barleystripemosaicvirus，BSMV）是目前唯一能在小麥以及大麥上實(shí)現(xiàn)的VIGS載體，2002年，Holzberg等首次在大麥上成功建立了VIGS體系，將大麥PDS部分序列插入經(jīng)過(guò)改造的BMSV的γ鏈中，通過(guò)摩擦接種大麥葉片，成功誘導(dǎo)了大麥內(nèi)源PDS的基因沉默（Holzberg等，2002）。Scofieid等在小麥上成功建立了BSMV介導(dǎo)的VIGS體系，研究了Lr21介導(dǎo)的葉銹病抗性通路中RAR1、SGT1以及HSP90三個(gè)基因的功能（Scofield等，2005）。11 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第一章引言1.4本論文研究目的及意義病毒致病因子與植物體內(nèi)相關(guān)蛋白互作，改變了寄主植物正常的生理生化過(guò)程，從而誘導(dǎo)相關(guān)癥狀的發(fā)生。然而由于小麥龐大而復(fù)雜的基因組，使得研究小麥病毒與植物之間的相互作用關(guān)系變得十分困難。近年來(lái)，第二代測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展為研究基因表達(dá)及調(diào)控、基因功能、蛋白/核酸互作等帶來(lái)極大的方便。本研究利用RNA-Seq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)WDV侵染下小麥轉(zhuǎn)錄組以及miRNA進(jìn)行深度測(cè)序。依據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析差異表達(dá)基因時(shí)，重點(diǎn)選擇與植物激素、光合作用、防衛(wèi)反應(yīng)等相關(guān)基因，以期解析WDV誘導(dǎo)的矮化、黃化、分蘗異常等癥狀形成的原因；對(duì)病毒侵染誘導(dǎo)寄主miRNA差異表達(dá)分析時(shí)，重點(diǎn)通過(guò)miRNA與靶標(biāo)基因的負(fù)相關(guān)聯(lián)合分析，來(lái)獲得了一些miRNA參與的重要調(diào)控信息。寄主植物轉(zhuǎn)錄譜表達(dá)變化以及miRNA的差異表達(dá)反映了寄主受到WDV侵染以后體內(nèi)多個(gè)代謝途徑的改變，這為揭示病毒致病的分子機(jī)理提供重要參考。另外，嘗試構(gòu)建WDV中國(guó)分離物的侵染性克隆，為從更深層次研究病毒致病機(jī)理提供有效的工具，而且侵染性克隆在研究病毒誘導(dǎo)的基因沉默、解析病毒基因功能以及品種抗病鑒定等方面也具有積極意義。12 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第二章小麥矮縮病毒侵染小麥的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及差異表達(dá)基因分析第二章小麥矮縮病毒侵染小麥的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及差異表達(dá)基因分析植物病毒從侵染初期到癥狀的發(fā)生是一個(gè)錯(cuò)綜復(fù)雜的過(guò)程，這是由于病毒與寄主的基因產(chǎn)物會(huì)發(fā)生互作。在此期間，病毒通過(guò)釋放致病因子干擾寄主植物基因的正常表達(dá)，同樣寄主為清除病毒會(huì)積極調(diào)動(dòng)防御機(jī)制，當(dāng)控制植物正常生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)節(jié)因子失去了作用以及植物抗病相關(guān)通路受到抑制時(shí)，隨即誘導(dǎo)形成癥狀，造成危害。無(wú)論是研究病毒侵染過(guò)程中細(xì)胞基因表達(dá)模式的改變、尋找具有重要功能的基因，甚至發(fā)掘寄主體內(nèi)SSR分子標(biāo)記等等，都可以通過(guò)分析病毒侵染以后寄主植物轉(zhuǎn)錄組水平的差異變化來(lái)獲得大量的信息。近些年來(lái)，高通量測(cè)序技術(shù)的廣泛應(yīng)用給許多生物轉(zhuǎn)錄組學(xué)的分析帶來(lái)了新的思路和方法。在眾多轉(zhuǎn)錄組的研究方法中，深度RNA測(cè)序技術(shù)（RNA-Seq）以其較高的重現(xiàn)性與靈敏度而備受青睞，而且無(wú)需完整的基因組圖譜以及大量的生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)，更重要的是不僅可以檢測(cè)低豐度表達(dá)的基因，且表達(dá)值與蛋白質(zhì)水平的關(guān)聯(lián)度也更好，因此它比生物芯片更加有效。本研究應(yīng)用RNA-Seq測(cè)序技術(shù)對(duì)WDV侵染前后小麥在RNA水平上的基因表達(dá)變化情況進(jìn)行分析，重點(diǎn)篩選與病毒癥狀形成以及植物抗病相關(guān)的基因，利用qPCR方法對(duì)選擇的差異表達(dá)基因進(jìn)行驗(yàn)證，以期通過(guò)寄主植物轉(zhuǎn)錄譜的差異變化來(lái)揭示病毒致病的分子機(jī)制。2.1材料與方法2.1.1材料2.1.1.1傳毒介體及植物材料小麥矮縮病毒毒源、傳毒介體異沙葉蟬以及高感小麥矮縮病的小麥品種揚(yáng)麥12號(hào)均由本實(shí)驗(yàn)室繁殖和保存。2.1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑SYBR?PremixExTaq?II(TliRNaseHPlus)、PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser(PerfectRealTime)購(gòu)自TaKaRa公司，提取高純度RNA所用TRIzol購(gòu)自Invitrogen公司，其他試劑與耗材均購(gòu)自國(guó)內(nèi)生化試劑廠商。2.1.2方法2.1.2.1用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析RNA樣品的準(zhǔn)備利用本實(shí)驗(yàn)室接種并傳毒擴(kuò)繁的WDV獲毒小麥植株，對(duì)介體昆蟲(chóng)異沙葉蟬進(jìn)行飼毒，3-4天后將介體昆蟲(chóng)轉(zhuǎn)移至一心一葉的健康小麥植株上進(jìn)行傳毒，同時(shí)以健康小麥作為對(duì)照，觀察接種植株的發(fā)病情況。在溫室接種條件下，第20天時(shí)植株出現(xiàn)典型癥狀，本研究目的在于比較顯癥葉片與健康葉片之間的基因表達(dá)差異，故在接種后第20天采集出現(xiàn)典型癥狀的感染病毒的小麥葉片以及同時(shí)期的健康對(duì)照組小麥葉片。樣品的收集方法為：將8株顯癥的小麥葉片全部剪碎，混合均勻后取樣，健康樣品收集方法與此相同，RNA提取的具體步驟如下：（1）取感染W(wǎng)DV與健康的新鮮小麥葉片各0.1g，加液氮充分研磨，向樣品粉末中分別加13 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第二章小麥矮縮病毒侵染小麥的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及差異表達(dá)基因分析入1mlTRIzol試劑后繼續(xù)研磨，室溫靜置5min；（2）將TRIzol試劑與樣品粉末的混合物移至1.5ml去酶離心管中，加入200μl氯仿后劇烈振蕩15s，室溫靜置2-3min；（3）冷凍離心機(jī)中以12000rpm，4℃，離心15min；（4）小心吸取450-500μl上清液，置于新的1.5ml去酶離心管中，加入等體積的異丙醇，輕輕搖勻，室溫靜置10min；（5）冷凍離心機(jī)中以12000rpm，4℃，離心15min；（6）棄上清，加入1ml70%的無(wú)水乙醇（滅菌的DEPCddH2O配制）洗滌沉淀；（7）冷凍離心機(jī)中以7500rpm，4℃，離心5min；（8）在超凈工作臺(tái)中干燥沉淀，加入40-60μl滅菌的DEPCddH2O溶解；（9）NanoDrop-2000紫外分光光度計(jì)（ThermoScientific）檢測(cè)RNA的質(zhì)量和濃度，以確保達(dá)到要求，-70℃保存所提取的總RNA，準(zhǔn)備送往公司進(jìn)行測(cè)序。2.1.2.2小麥轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-Seq）將提取的健康小麥(命名為CK組)與獲毒小麥葉片RNA(命名為W20組)兩組樣品送達(dá)北京貝瑞和康生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，樣品的具體信息見(jiàn)表2.1。表2.1樣品信息匯總Table2.1Informationofthesamples樣品編號(hào)體積（μl）濃度（ng/μl）總量（μg）物種樣品質(zhì)量備注CK42202685.09小麥合格健康小麥W205450627.32小麥合格感染W(wǎng)DV的小麥（20dpi)2.1.2.3反轉(zhuǎn)錄體系按照PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser(PerfectRealTime)試劑盒說(shuō)明書(shū)上描述的方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄操作，具體步驟如下：（1）5×gDNAEraserBuffer2.0μlgDNAEraser1.0μlTotalRNA1.0μgRNaseFreedH2O補(bǔ)至總體積10.0μl（2）將步驟（1）中的混合物置于42℃2min或者室溫條件下靜置5min；（3）5×PrimeScriptBuffer24.0μlPrimeScriptRTEnzymeMixI1.0μlRTPrimerMix4.0μlRNaseFreedH2O1.0μl總體積10.0μl14 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第二章小麥矮縮病毒侵染小麥的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及差異表達(dá)基因分析（4）將步驟(1)與(3)中的兩種反應(yīng)物混合均勻，37℃放置15min后，85℃變性5s即可。2.1.2.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系及內(nèi)參基因的選擇利用qPCR方法對(duì)篩選出來(lái)的感興趣的差異表達(dá)基因進(jìn)行分析驗(yàn)證，驗(yàn)證時(shí)為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的科學(xué)性，設(shè)置了3次技術(shù)性重復(fù)，3次生物學(xué)重復(fù)。選擇了4個(gè)在小麥體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)的持家基因作為內(nèi)參基因，分別是翻譯延伸因子1A（EF-1α）、GTP結(jié)合蛋白（GTPB）、蛋白磷酸酶2A（PP2A）、β微管蛋白[TUBβ(Tubb4)]。依據(jù)SYBR?PremixExTaq?II(TliRNaseHPlus)試劑盒說(shuō)明書(shū)中的進(jìn)行qPCR操作，反應(yīng)體系如下：SYBRPremixExTaqII(TliRNaseHPlus)(2×)10.0μl上游引物(10μM)0.8μl下游引物(10μM)0.8μlROXReferenceDyeII(50×)0.4μl模板2.0μl滅菌ddH2O6.0μl總體積20.0μl2.1.2.5引物設(shè)計(jì)與合成內(nèi)參基因的引物依據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)以及GenBank上登錄的部分序列設(shè)計(jì)，而待驗(yàn)證的差異表達(dá)基因引物直接依據(jù)測(cè)序獲得的unigene序列設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)好的引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，相關(guān)引物的具體序列信息見(jiàn)附錄。2.2結(jié)果與分析2.2.1小麥轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的處理與生物信息學(xué)分析2.2.1.1原始數(shù)據(jù)的處理由Illumina（RNA-Seq）高通量測(cè)序獲得了健康對(duì)照組（CK）11.24Gb與病毒感染組（W20）9.87Gb的原始數(shù)據(jù)，由于原始數(shù)據(jù)的產(chǎn)生經(jīng)過(guò)了核酸提取、建庫(kù)及測(cè)序等多個(gè)環(huán)節(jié)，此過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量對(duì)后續(xù)生物信息數(shù)據(jù)高級(jí)分析帶來(lái)嚴(yán)重干擾的冗余數(shù)據(jù)，比如建庫(kù)階段會(huì)出現(xiàn)建庫(kù)長(zhǎng)度的偏差，測(cè)序階段會(huì)出現(xiàn)測(cè)序錯(cuò)誤的情況。通過(guò)一些手段將原始測(cè)序數(shù)據(jù)中包含的接頭序列，低質(zhì)量堿基，未測(cè)出的堿基（以N表示）等無(wú)效數(shù)據(jù)去除掉，最終得到了健康對(duì)照組11.01Gb與病毒感染組8.75Gb的有效數(shù)據(jù)（cleandata），以fastq文件格式存儲(chǔ)，經(jīng)過(guò)這樣的數(shù)據(jù)過(guò)濾后可以保證生物信息學(xué)分析的正常進(jìn)行。原始測(cè)序數(shù)據(jù)（rawdata）按照以下方法進(jìn)行過(guò)濾：（1）需要過(guò)濾掉含有接頭序列的reads；（2）當(dāng)任意一端read中含有的N的含量超過(guò)read長(zhǎng)度的3%時(shí)，需要去除此對(duì)reads；（3）當(dāng)任意一端read中含有的低質(zhì)量(低于3)堿基數(shù)超過(guò)read長(zhǎng)度的50%時(shí)，需要去除此對(duì)reads。2.2.1.2轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的拼接與基因注釋15 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第二章小麥矮縮病毒侵染小麥的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及差異表達(dá)基因分析利用Trinity軟件對(duì)獲得的有效數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接，將獲得的contig經(jīng)過(guò)聚類分析后共得到77221條unigene，其中所有unigene的平均長(zhǎng)度為1286bp，UnigeneN50為1525bp，所有unigene長(zhǎng)度的中位數(shù)為1042bp。健康對(duì)照組以及病毒感染組的相關(guān)數(shù)據(jù)見(jiàn)表2.2。為了全面了解unigene序列中蘊(yùn)含的生物信息，將轉(zhuǎn)錄組獲得的全部序列比對(duì)到水稻及擬南芥基因組上，得到與給定unigene具有最高序列相似性的蛋白(E-value<1e-5)。結(jié)果顯示，獲得的77221條序列與同為禾本科的水稻以及模式植物擬南芥都具有相當(dāng)數(shù)量的同源基因，50048條序列與水稻有同源匹配信息，40803條序列與擬南芥有同源匹配信息，這些信息的獲得使我們對(duì)小麥轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果有了概括性的了解。表2.2轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)拼接結(jié)果Table2.2Assemblyresultsoftranscriptomedata聚類后健康對(duì)照組（CK）病毒感染組（W20）TotalUnigene772216772085587UnigeneN50(bp)152511121102UnigeneAveragesequencelength(bp)1286.66700.79703.30UnigeneMediansequencelength(bp)1042416421TotalTranscript95101125281TranscriptN5012221209TranscriptAveragesequencelength793.62800.03TranscriptMediansequencelength512526N50length122212092.2.1.3RNA-Seq相關(guān)性檢驗(yàn)以及轉(zhuǎn)錄組Mapping數(shù)據(jù)不同樣品之間基因表達(dá)水平的相關(guān)性是檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否可靠以及樣品選擇是否科學(xué)的重要衡量標(biāo)準(zhǔn)，因此，需要對(duì)高通量測(cè)序結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性（圖2.1）以及均一性分布檢驗(yàn)（圖略）。本研究中spearman與kendall-tau兩個(gè)相關(guān)系數(shù)均大于0.9，而相關(guān)系數(shù)越接近1，表明樣品之間基因的表達(dá)模式的一致性越高。本研究分析的物種為小麥，沒(méi)有參考轉(zhuǎn)錄組，故需要對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝，得到ReferenceSequence，再采用BWA軟件將測(cè)序結(jié)果中的短序列Mapping到參考基因組上，Mapping率的高低直接關(guān)系到基因表達(dá)量的計(jì)算以及后續(xù)的生物信息學(xué)分析。表2.3顯示健康對(duì)照組（CK）與感染病毒組（W20）reads的Mapping率分別達(dá)到了0.99與0.98，UniqueMapping率也分別達(dá)到0.887與0.708。16 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第二章小麥矮縮病毒侵染小麥的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及差異表達(dá)基因分析圖2.1RNA-Seq相關(guān)性檢驗(yàn)Fig.2.1CorrelationtestofRNA-Seq表2.3轉(zhuǎn)錄組Mapping數(shù)據(jù)Table2.3Mapping_StatisticsofshortreadsStatisticsTermResult(CKgroup)Result(W20group)AllReads10650604980358039UnMapped10316761571274MappedReads10547437378786765MappingRate0.990.98UniqueMapping9450458656898394UniqueMappingRate0.8870.708RepeatMapping10969787218883712.2.1.4基于RNA-Seq數(shù)據(jù)對(duì)小麥SSR分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)單重復(fù)序列(Simplesequencerepeats，SSR)遺傳位點(diǎn)廣泛分布于所有原核生物和真核生基因組中，具有分布豐富性、遺傳共顯性和技術(shù)簡(jiǎn)單性等特點(diǎn)。本研究利用新一代的高通量Illumina測(cè)序技術(shù)獲得的小麥轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來(lái)開(kāi)發(fā)小麥功能基因組SSR分子標(biāo)記。使用MISA（MIcroSAtelliteidentificationtool）通過(guò)以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選：?jiǎn)魏塑账嶂貜?fù)次數(shù)10次或10次以上，二核苷酸重復(fù)次數(shù)6次或6次以上，三核苷酸至六核苷酸重復(fù)次數(shù)5次及5次以上，結(jié)果共獲得了12404個(gè)SSR17 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第二章小麥矮縮病毒侵染小麥的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及差異表達(dá)基因分析位點(diǎn)，這些位點(diǎn)分布于10717個(gè)Unigenes上（表2.4）。從重復(fù)序列類型分布來(lái)看，小麥轉(zhuǎn)錄組SSRs種類十分豐富，主要集中在單核苷酸重復(fù)單元、二核苷酸重復(fù)單元及三核苷酸重復(fù)單元，三者的總和占到了全部SSRs的95.65%，三核苷酸重復(fù)單元數(shù)量最多，占到了總數(shù)的51.18%（圖2.2）。從各種類型核苷酸重復(fù)單元出現(xiàn)的頻率來(lái)看，單核苷酸重復(fù)單元中出現(xiàn)頻率最高的是A/T，占SSRs總數(shù)的20.95%，C/G只占了1.84%；二核苷酸重復(fù)單元中，AC/GT、AG/CT占了大多數(shù)，其次的類型為AT/AT、CG/CG；三核苷酸重復(fù)單元中，CCG/CGG具有絕對(duì)的數(shù)量?jī)?yōu)勢(shì)，共有2240個(gè)，占了SSRs總數(shù)的18.06%，其他類型如AGC/CTG、AGG/CCT、ACC/GGT、ACG/CGT等出現(xiàn)的頻率也較高，余下的多核苷酸重復(fù)單元?jiǎng)t分布較為分散。綜合分析，小麥體內(nèi)SSR遺傳位點(diǎn)數(shù)量多且豐富，具有很高的實(shí)用性。表2.4微衛(wèi)星DNA搜索結(jié)果Table2.4ResultsofmicrosatellitesearchCategoryNumberTotalnumberofsequencesexamined77221Totalsizeofexaminedsequences(bp)99356869TotalnumberofidentifiedSSRs12404NumberofSSRcontainingsequences10717Numberofsequencescontainingmorethan1SSR1446NumberofSSRspresentincompoundformation551圖2.2不同重復(fù)序列類型的分布Fig.2.2Distributiontodifferentrepeattypeclasses18 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第二章小麥矮縮病毒侵染小麥的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及差異表達(dá)基因分析2.2.1.5轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中基因表達(dá)量的計(jì)算以及差異基因的提取為了探究WDV侵染對(duì)寄主小麥生長(zhǎng)發(fā)育中生理生化過(guò)程產(chǎn)生的影響，需要對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行基因表達(dá)量的計(jì)算。采用國(guó)際精確算法Counts、RPKM(ReadsPerKilobaseofexonMillionmappedsequencereads)進(jìn)行基因表達(dá)定量，RPKM即每1百萬(wàn)個(gè)map上的reads中map到外顯子的每1千個(gè)堿基上的reads個(gè)數(shù)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，在健康對(duì)照組中有75.0%以上unigene的RPKM值大于0.2，在病毒感染組中有95.0%以上unigene的RPKM值大于0.2，這表明即使在基因表達(dá)豐度很低的情況下，應(yīng)用高通量測(cè)序方法仍可以檢測(cè)到基因的表達(dá)。應(yīng)用EB_Seq算法篩選健康對(duì)照組（CK）與感染病毒組之間的差異表達(dá)基因。篩選過(guò)程是基于counts的數(shù)據(jù)，而不是RPKM，篩選的條件是FDR(FalseDiscoveryRate)<0.05，log2FC>1或log2FC<-1。經(jīng)過(guò)這樣的顯著性分析與FDR分析之后，就獲得了2倍以上表達(dá)差異變化的差異表達(dá)基因。對(duì)于無(wú)生物學(xué)重復(fù)的實(shí)驗(yàn)來(lái)講，可以通過(guò)上述差異倍數(shù)以及顯著性水平對(duì)差異基因進(jìn)行篩選，這樣處理可以消除由于生物學(xué)變異帶來(lái)的誤差。為了更直觀地反映差異表達(dá)基因的整體分布情況，以log2foldchange為橫坐標(biāo)，以-log2FDR為縱坐標(biāo)，繪制了差異基因的火山圖（VolcanoPlot），見(jiàn)圖2.3。圖2.3差異基因火山圖Fig.2.3VolcanoPlotofdifferentiallyexpressedgenes2.2.1.6差異表達(dá)基因的GO與Pathway分析雖然到目前為止，普通小麥基因組草圖幾近繪制完成，但是由于小麥基因組極其龐大與復(fù)雜，而且大量基因的功能未知，因此我們?cè)谵D(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析中，差異表達(dá)基因的功能注釋與分類分析工作，仍然主要參考模式植物水稻和擬南芥來(lái)進(jìn)行。通過(guò)FDR錯(cuò)誤控制方法以及l(fā)og2FC表達(dá)差異倍數(shù)的限制，共獲得了4324個(gè)具有顯著表達(dá)差異的基因，感染病毒組（W20）相對(duì)于健康對(duì)照組（CK），上調(diào)表達(dá)的基因有2136個(gè)，下調(diào)表達(dá)的基因有2188個(gè)。在上調(diào)表達(dá)的基因中，與水稻數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后有同源信息的1733個(gè)，在NCBI中有具體功能描述的1673個(gè)，與擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后有同源信息的1430個(gè)，在NCBI中有具體功能描述的1382個(gè)；在下調(diào)表達(dá)的基因中，與水稻數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后有同源信息的1222個(gè)，在NCBI中有具體功能描述的1011個(gè)，與擬南芥數(shù)19 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第二章小麥矮縮病毒侵染小麥的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及差異表達(dá)基因分析據(jù)庫(kù)比對(duì)后有同源信息的974個(gè)，在NCBI中有具體功能描述的824個(gè)，見(jiàn)圖2.4。圖2.4差異表達(dá)基因上下調(diào)情況Fig.2.4Overviewofthedifferentiallyexpressedgenes2.2.1.7差異表達(dá)基因GO分類分析使用Fisher對(duì)所有的4324個(gè)顯著差異表達(dá)基因進(jìn)行功能分類，就是計(jì)算這些差異基因同GO分類中某個(gè)特定分支的超幾何分布關(guān)系，GO分析會(huì)對(duì)每個(gè)有差異基因存在的GO輸出一個(gè)p-value，較小的p值(p<0.05)表示差異基因在該GO中出現(xiàn)了富集。按照生物學(xué)過(guò)程(Biologicalprocess)、細(xì)胞組分(Cellularcomponent)和分子功能(Molecularfunction)三大亞類進(jìn)行分析和匯總，從圖2.5可以看出，當(dāng)病毒侵染以后，寄主小麥體內(nèi)差異表達(dá)基因涉及的主要生物學(xué)過(guò)程有老化、對(duì)抗壓力做出響應(yīng)、磷饑餓反應(yīng)、對(duì)有毒物質(zhì)的反應(yīng)、光合作用、DNA復(fù)制及代謝、系統(tǒng)獲得性抗性、植物先天性抗性、基因沉默、氧化壓力下的反應(yīng)、碳水化合物代謝過(guò)程、生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)節(jié)等；差異表達(dá)基因涉及到的細(xì)胞組分主要是細(xì)胞內(nèi)、胞外結(jié)構(gòu)域、質(zhì)外體、細(xì)胞壁、細(xì)胞質(zhì)膜邊界囊泡、光系統(tǒng)I與II、葉綠體被膜等；差異表達(dá)基因涉及到的分子功能主要有酸性磷酸酶活性、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶活性、水解酶活性、電子載體活性、糖類跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)子活性、氧化還原酶活性、氧結(jié)合活性等。20 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第二章小麥矮縮病毒侵染小麥的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及差異表達(dá)基因分析BiologicalprocessCellularcomponentMolecularfunction圖2.5小麥轉(zhuǎn)錄組GO功能分類Fig.2.5GOclassificationofTriticumaestivumtranscriptome2.2.1.8差異表達(dá)基因Pathway分析同GO分析類似，Pathway分析獲得較小的p值(p<0.05)表示差異基因在該代謝通路中出現(xiàn)了富集。通過(guò)差異基因的Pathway分析，可以找到富集差異基因的Pathway條目，從而找到不同樣品的差異基因可能與哪些代謝通路的改變有關(guān)。Pathway分析的結(jié)果顯示的是蛋白質(zhì)之間的相互作用，Pathway的變化可以由參與這條Pathway途徑的蛋白的表達(dá)量或者蛋白的活性改變而引起。圖2.6顯示的是以富集度的大小來(lái)衡量差異表達(dá)基因在各代謝通路上的分布情況，本研究所篩選出來(lái)的差異表達(dá)基因主要參與的代謝通路有淀粉與蔗糖代謝、谷胱甘肽代謝、DNA復(fù)制、半乳糖代謝、黃酮類物質(zhì)合成、雙萜類物質(zhì)合成、苯丙素生物合成、錯(cuò)配修復(fù)、同源重組、檸檬烯與蒎烯降解、氨基糖與核苷酸糖代謝、吲哚生物堿合成、植物生理節(jié)律調(diào)節(jié)等等。差異表達(dá)基因參與了眾多的信號(hào)通路，通過(guò)構(gòu)建信號(hào)通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，可以從整體層面了解Pathway之間的信號(hào)傳遞關(guān)系，而且從調(diào)控網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖中可以找到與本實(shí)驗(yàn)密切相關(guān)的核心Pathway（圖2.7）。分析結(jié)果表明，氨基糖與核苷酸糖代謝途徑、苯丙素生物合成途徑等處于代謝通路較為核心的位置，在信號(hào)傳遞及基因調(diào)控方面發(fā)揮重要作用。為了更直觀地了解轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中涉及到的參與主要代謝通路的基因間互作情況，本研究還利用顯著性Pathway中的水稻基因構(gòu)建了基因間相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，圖2.8顯示該網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖中涉及到的主要是淀粉及蔗糖代謝途徑中的相關(guān)基因，如蔗糖合成酶（Sucrosesynthase）、淀粉分解酶（Alpha-amylaseisozyme2Aprecursor）、果糖激酶（Fructokinase1）等；以及赤霉素合成途徑中貝殼杉烯合成酶（KaurenesynthaseA）基因與萜類化合物合成酶（Terpenoidsynthasedomaincontainingprotein）基因之間的互作關(guān)系；酪氨酸/尼克酰胺轉(zhuǎn)氨酶、過(guò)氧化物酶基因與酪氨酸/多巴脫羧酶基因之間的互作關(guān)系，另外，從圖中還可以發(fā)現(xiàn)糖基轉(zhuǎn)移酶在單半乳糖甘油二酯（MGDG）合成途徑的重要作用，MGDG是植21 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第二章小麥矮縮病毒侵染小麥的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及差異表達(dá)基因分析物光合膜的主要組分，其在病毒侵染后基因表達(dá)的顯著變化，對(duì)于揭示寄主植物光合作用效率下降具有重要意義。圖2.6小麥轉(zhuǎn)錄組Pathway富集分析Fig.2.6PathwayEnrichmentanalysisofTriticumaestivumtranscriptome圖2.7小麥轉(zhuǎn)錄組信號(hào)通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)Fig.2.7Pathway-Act-NetworkofTriticumaestivumtranscriptome22 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第二章小麥矮縮病毒侵染小麥的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及差異表達(dá)基因分析圖2.8小麥轉(zhuǎn)錄組基因互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)（以水稻基因表示）Fig.2.8Gene-Act-NetworkofTriticumaestivumtranscriptome（Thenetworkisshownwithgenesofrice）注：紅色表示基因表達(dá)上調(diào)，綠色表示基因表達(dá)下調(diào)，黃色表示該P(yáng)athway中的相關(guān)基因既有上調(diào)又有下調(diào)表達(dá)表2.4基因互作網(wǎng)絡(luò)中相關(guān)基因的描述Table2.4DescriptionofthegenesinGene-Act-NetworkBlasttoRice_SymbolPathwayBlast_DescriptionOs04g0309600path:osa00500SucrosesynthaseOs01g0894300path:osa00500Fructokinase1Os07g0616800path:osa00500Sucrose-UDPglucosyltransferase3Os01g0966700path:osa00500Beta-fructofuranosidaseOs03g0401300path:osa00500Sucrose-UDPglucosyltransferase2Os02g0528200path:osa00500Branchingenzyme-3Os04g0535600path:osa00500Beta-fructofuranosidase1precursorAlpha-amylaseisozyme2AprecursorOs06g0713800path:osa00500(1,4-alpha-D-glucanglucanohydrolase)Os03g0212800path:osa00500Beta-glucosidaseOs09g0397300path:osa00500HAD-superfamilyhydrolasesubfamilyIIBproteinOs02g0106100path:osa00500FructosyltransferaseOs01g0142300path:osa00561Glycosyltransferase,group1domaincontainingproteinOs08g0299400path:osa00561MGDGsynthasetypeAOs04g0611800path:osa00904TerpenoidsynthasedomaincontainingproteinOs02g0278700path:osa00904KaurenesynthaseAOs05g0510600path:osa00360Tyrosine/DOPAdecarboxylase1.Os08g0113000path:osa00360Peroxidase47precursorOs11g0552000path:osa00360Tyrosine/nicotianamineaminotransferasesfamilyprotein23 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第二章小麥矮縮病毒侵染小麥的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及差異表達(dá)基因分析2.2.2目標(biāo)基因的選擇本節(jié)重點(diǎn)對(duì)病毒癥狀形成以及寄主植物防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān)因子進(jìn)行選擇，分別篩選植物激素代謝或運(yùn)輸相關(guān)基因、植物光合作用反應(yīng)過(guò)程及葉綠素代謝相關(guān)基因、植物抗逆反應(yīng)相關(guān)基因，還有一些與基因沉默相關(guān)基因、轉(zhuǎn)錄因子等。2.2.2.1植物激素代謝或運(yùn)輸相關(guān)基因前文已經(jīng)提及到植物激素在細(xì)胞分裂與伸長(zhǎng)、組織與器官分化、開(kāi)花結(jié)實(shí)、成熟衰老、休眠萌發(fā)等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，它們分別或相互協(xié)調(diào)地調(diào)控著植物的生長(zhǎng)、發(fā)育與分化。內(nèi)源激素含量與穩(wěn)態(tài)平衡是保證植物正常生理過(guò)程的有序進(jìn)行的前提，病毒的侵染有可能打破植物體內(nèi)這種穩(wěn)態(tài)平衡，導(dǎo)致小麥發(fā)育遲緩、葉片黃化、分蘗異常等癥狀的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)在WDV侵染前后，許多與生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素、赤霉素、脫落酸、油菜素內(nèi)酯等蛋白修飾、運(yùn)輸、代謝或者信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因表達(dá)發(fā)生顯著變化。這些基因包括與生長(zhǎng)素運(yùn)輸、合成及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸外流載體（Effluxcarrierofpolarauxintransport），吲哚-3-甘油磷酸合酶（Indole-3-glycerolphosphatesynthase），AUX/IAA蛋白（IAA8），生長(zhǎng)素響應(yīng)因子10（Auxinresponsefactor10），羥基肉桂酰輔酶A莽草酸/奎尼酸羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶（Hydroxycinnamoyl-CoAshikimate/quinatehydroxycinnamoyltransferase）等；與細(xì)胞分裂素修飾及運(yùn)輸相關(guān)的細(xì)胞分裂素N-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶1（Cytokinin-N-glucosyltransferase1），嘌呤透性酶10（Purinepermease10）等；與赤霉素合成相關(guān)的內(nèi)根-貝殼杉烯合成酶（Ent-kaurenesynthase-like3），與脫落酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的F-BOXWITHWD-402及與油菜素內(nèi)酯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的富含亮氨酸重復(fù)序列（LRR）油菜素甾醇受體激酶（BrassinosteroidLRRreceptorkinase）等。這些基因中，除了抑制生長(zhǎng)素運(yùn)輸?shù)牧u基肉桂酰輔酶A莽草酸/奎尼酸羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶（HCT）、F-BOXWITHWD-402、細(xì)胞分裂素N-糖基轉(zhuǎn)移酶1（Cytokinin-N-glucosyltransferase1）以及參與細(xì)胞分裂素跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的嘌呤透性酶（Purinepermease10）基因表達(dá)上調(diào)，其余基因均下調(diào)表達(dá)。表2.5與植物激素相關(guān)基因Table2.5DifferentiallyexpressedgenesrelatedtophytohormoneBlasttoRice_AccIDLog2FCFDRE-valueBlast_DescriptionLOC_Os03g17310.1-1.9670.036601.00E-10EffluxcarrierofpolarauxintransportLOC_Os05g44810-1.8150.021682.00E-89IAA8LOC_Os04g43910.1-2.0530.018192.00E-16Auxinresponsefactor10LOC_Os08g23150.1-2.6712.67E-070Indole-3-glycerolphosphatesynthase-likeHydroxycinnamoyl-CoAshikimate/quinateLOC_Os10g238202.4430.0039930hydroxycinnamoyltransferaseLOC_Os07g13800.16.6211.75E-098.00E-146Cytokinin-N-glucosyltransferase1LOC_Os04g497572.2660.039713.00E-109Purinepermease10LOC_Os04g52210.1-4.8031.84E-110Ent-kaurenesynthase-like3LOC_Os06g11630.120.006.52E-051.00E-46TA2protein/F-BOXWITHWD-402LOC_Os01g52050.1-2.7454.61E-050BrassinosteroidLRRreceptorkinase24 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第二章小麥矮縮病毒侵染小麥的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及差異表達(dá)基因分析2.2.2.2光合作用及葉綠素代謝相關(guān)基因小麥矮縮病毒侵染以后，寄主葉片中葉綠體超微結(jié)構(gòu)遭到嚴(yán)重破壞，多數(shù)小麥植株多數(shù)會(huì)出現(xiàn)褪綠黃化的癥狀，這與植物光合作用速率的下降、葉綠素代謝的異常以及膜脂過(guò)氧化作用都有密切關(guān)系。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果表明，差異表達(dá)基因中許多都與光合作用以及葉綠素代謝有關(guān)，包括光合作用關(guān)鍵酶RuBisCO小亞基及RuBisCO活化酶、捕光色素蛋白復(fù)合體I結(jié)合蛋白（LHCItypeIVchlorophyllbindingprotein）、參與葉綠素合成的原葉綠素酸酯氧化還原酶（Protochlorophyllidereductase）及葉綠素分解的紅色葉綠素代謝產(chǎn)物還原酶（Redchlorophyllcatabolitereductase)、葉綠體前體中的碳酸酐酶（Carbonicanhydrase,chloroplastprecursor）及非綠質(zhì)體葉綠體前體中的磷酸丙糖/磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Triosephosphate/phosphatetranslocator,non-greenplastid,chloroplastprecursor）等等。表2.6光合作用及葉綠素相關(guān)基因Table2.6DifferentiallyexpressedgenesrelatedtophotosynthesisandchlorophyllBlasttoRice_AccIDLog2FCFDRE-valueBlast_DescriptionRibulose1,5-bisphosphatecarboxylaseLOC_Os12g17600-20.0006.00E-61smallsubunitmRNALOC_Os04g56320.1-1.7340.012841.00E-132RuBisCOactivaseLOC_Os08g33820.1-20.008.31E-041.00E-88LHCItypeIVchlorophyllbindingproteinLOC_Os10g35370-2.2970.045995.00E-125ProtochlorophyllidereductaseBLOC_Os10g25030.14.7062.85E-103.00E-111RedchlorophyllcatabolitereductaseLOC_Os01g45274-20.002.10E-077.00E-77Carbonicanhydrase,chloroplastprecursorLOC_Os01g07730.1-2.3393.86E-049.00E-115Triosephosphate/phosphatetranslocator2.2.2.3植物抗逆反應(yīng)及基因沉默相關(guān)基因、轉(zhuǎn)錄因子寄主植物受到病毒侵染以后會(huì)啟動(dòng)防御機(jī)制以減輕病原造成的危害，例如水楊酸途徑、茉莉酸途徑、基因沉默途徑、抗氧化防護(hù)系統(tǒng)、誘導(dǎo)產(chǎn)生病原相關(guān)蛋白(PRs)等等。本研究的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中同樣檢測(cè)到了上述抗逆途徑中某些基因表達(dá)的顯著變化，重點(diǎn)篩選了在植物體內(nèi)活性氧清除等防護(hù)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用的超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）相關(guān)基因，siRNA介導(dǎo)的基因沉默中發(fā)揮作用的AGO4基因，激活水楊酸途徑的WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員WRKYDNA結(jié)合蛋白70（WRKYDNA-bindingprotein70）以及對(duì)水楊酸刺激做出響應(yīng)的在細(xì)胞間溝通與細(xì)胞生長(zhǎng)中起重要作用的細(xì)胞壁相關(guān)激酶（Wall-associatedkinase2）等。25 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第二章小麥矮縮病毒侵染小麥的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及差異表達(dá)基因分析表2.7植物抗逆反應(yīng)及基因沉默相關(guān)基因、轉(zhuǎn)錄因子Table2.7Differentiallyexpressedgenesrelatedtogenesilencing,defenseresponseandtranscriptionfactorsBlasttoRice_AccIDLog2FCFDRE-valueBlast_DescriptionLOC_Os08g44770-2.1962.22E-042.00E-80SuperoxidedismutaseLOC_Os08g02110.15.5271.06E-052.00E-149Peroxidase47precursorLOC_Os04g53300.120.000.0073021.00E-28PolyphenoloxidaseLOC_Os01g168702.0730.025400Argonaute4proteinLOC_Os05g40060.13.7346.92E-084.00E-55WRKYtranscriptionfactor48NM_001189956.14.6980.0022029.00E-121Wall-associatedkinase22.2.3熒光定量PCR方法對(duì)差異表達(dá)基因的驗(yàn)證分別以翻譯延伸因子1A（EF-1α）、GTP結(jié)合蛋白（GTPB）、蛋白磷酸酶2A（PP2A）、β微管蛋白[TUBβ(Tubb4)]為內(nèi)參基因，利用qPCR方法對(duì)篩選出來(lái)的差異表達(dá)基因進(jìn)行驗(yàn)證，在計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量時(shí)采用2-△△Ct法進(jìn)行分析。2.2.3.1植物激素相關(guān)基因的qPCR驗(yàn)證qPCR驗(yàn)證植物激素相關(guān)基因差異表達(dá)的結(jié)果（圖2.9）說(shuō)明促進(jìn)生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸?shù)纳L(zhǎng)素極性運(yùn)輸外流載體（Effluxcarrierofpolarauxintransport）、與色氨酸與吲哚乙酸生物合成有關(guān)的吲哚-3-甘油磷酸合酶（Indole-3-glycerolphosphatesynthase）、參與生長(zhǎng)素輸入過(guò)程的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)且對(duì)側(cè)根發(fā)育起正調(diào)節(jié)作用的生長(zhǎng)素響應(yīng)因子10（Auxinresponsefactor10）、AUX/IAA轉(zhuǎn)錄抑制子家族蛋白（IAA8）基因表達(dá)均下調(diào)，抑制生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)和植物生長(zhǎng)的羥基肉桂酰輔酶A莽草酸/奎尼酸羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶（Hydroxycinnamoyl-CoAshikimate/quinatehydroxycinnamoyltransferase）基因表達(dá)上調(diào)；細(xì)胞分裂素N-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶1（Cytokinin-N-glucosyltransferase1）與嘌呤透性酶10（Purinepermease10）基因上調(diào)表達(dá)反映出被侵染寄主體內(nèi)細(xì)胞分裂素含量的上升；赤霉素合成相關(guān)的內(nèi)根-貝殼杉烯合成酶（Ent-kaurenesynthase-like3）以及油菜素內(nèi)酯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的富含亮氨酸重復(fù)序列（LRR）油菜素甾醇受體激酶（BrassinosteroidLRRreceptorkinase）基因顯著下調(diào)，說(shuō)明病毒侵染抑制了植物赤霉素的生物合成以及油菜素內(nèi)酯的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，而與脫落酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的F-BOXWITHWD-402基因呈上調(diào)表達(dá)，這些結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)完全一致。綜合來(lái)看，病毒侵染造成寄主小麥體內(nèi)生長(zhǎng)素、赤霉素、油菜素內(nèi)酯等促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育的激素水平降低，這可能是造成感病植株矮化的重要原因；細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素的比例失調(diào)，可導(dǎo)致小麥分蘗發(fā)生異常。26 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第二章小麥矮縮病毒侵染小麥的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及差異表達(dá)基因分析圖2.9qPCR驗(yàn)證植物激素相關(guān)差異表達(dá)基因Fig.2.9ValidationofdifferentiallyexpressedgenesrelatedtophytohormonebyqPCR2.2.3.2光合作用及葉綠素代謝相關(guān)基因的qPCR驗(yàn)證對(duì)qPCR驗(yàn)證植物光合作用及葉綠素代謝相關(guān)基因差異表達(dá)的結(jié)果進(jìn)行分析（圖2.10），表現(xiàn)在光合作用關(guān)鍵酶RuBisCO小亞基異常升高，大小亞基比例失衡，而且RuBisCOactivase基因表達(dá)下調(diào)影響了RuBisCO活性。參與葉綠素分解的紅色葉綠素代謝產(chǎn)物還原酶（Redchlorophyllcatabolitereductase）也上調(diào)表達(dá)，以上基因的qPCR驗(yàn)證結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致。然而，參與葉綠素合成的原葉綠素酸酯氧化還原酶（Protochlorophyllidereductase）、與光保護(hù)作用有關(guān)的捕光色素蛋白復(fù)合體I結(jié)合蛋白（LHCItypeIVchlorophyllbindingprotein）、葉綠體前體中的碳酸酐27 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第二章小麥矮縮病毒侵染小麥的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及差異表達(dá)基因分析酶（Carbonicanhydrase,chloroplastprecursor）及非綠質(zhì)體葉綠體前體中的磷酸丙糖/磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Triosephosphate/phosphatetranslocator,non-greenplastid,chloroplastprecursor）基因均上調(diào)表達(dá)，qPCR驗(yàn)證結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)出現(xiàn)了相反的情況。圖2.10qPCR驗(yàn)證光合作用及葉綠素代謝相關(guān)的差異表達(dá)基因Fig.2.10ValidationofdifferentiallyexpressedgenesrelatedtophotosynthesisandchlorophyllbyqPCR2.2.3.3植物抗逆反應(yīng)及轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)基因的qPCR驗(yàn)證qPCR驗(yàn)證植物抗逆反應(yīng)及轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)基因差異表達(dá)的結(jié)果（圖2.11）說(shuō)明病毒侵染以后寄主植物體內(nèi)活性氧清除系統(tǒng)中的超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD），參與酚類、木質(zhì)素合成的多酚氧化酶（PPO）以及細(xì)胞生長(zhǎng)中起重要作用的細(xì)胞壁相關(guān)激酶2（Wall-associatedkinase2）基因表達(dá)下調(diào)，與siRNA介導(dǎo)的基因沉默密切相關(guān)的AGO4、植物特有的一類抗性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子WRKYDNA結(jié)合蛋白70（WRKYDNA-bindingprotein70）基因表達(dá)上調(diào)。值得商榷28 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第二章小麥矮縮病毒侵染小麥的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及差異表達(dá)基因分析的是，在本節(jié)驗(yàn)證的相關(guān)基因中，仍有一些與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)果相反，比如過(guò)氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）、細(xì)胞壁相關(guān)激酶2（Wall-associatedkinase2）基因在轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中是上調(diào)表達(dá)，而qPCR結(jié)果卻都是下調(diào)表達(dá)。總的來(lái)講，這些基因的表達(dá)變化在一定程度上反映了小麥在受到病毒侵襲以后，會(huì)調(diào)動(dòng)體內(nèi)某些防御機(jī)制應(yīng)對(duì)病毒造成的危害。圖2.11qPCR驗(yàn)證植物抗逆反應(yīng)及轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的差異表達(dá)基因Fig.2.11ValidationofdifferentiallyexpressedgenesrelatedtodefenseresponseandtranscriptionfactorsbyqPCR2.3總結(jié)與討論本研究利用RNA-Seq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)WDV侵染前后的小麥轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行深度測(cè)序，重點(diǎn)篩選與誘導(dǎo)病毒癥狀形成相關(guān)的差異表達(dá)基因以及寄主抗病防御反應(yīng)途徑中的相關(guān)基因，轉(zhuǎn)錄因子等，利用qPCR方法對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析驗(yàn)證。目的在于從RNA水平揭示病毒誘導(dǎo)癥29 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第二章小麥矮縮病毒侵染小麥的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及差異表達(dá)基因分析狀形成的致病分子機(jī)制、寄主對(duì)抗病毒侵染的防衛(wèi)反應(yīng)機(jī)理以及寄主與病毒之間的互作等。2.3.1WDV誘導(dǎo)寄主矮化癥狀的原因分析小麥在拔節(jié)期前受到病毒侵染會(huì)導(dǎo)致植株嚴(yán)重矮化，發(fā)病嚴(yán)重者不能抽穗，這是小麥矮縮病重要的癥狀表現(xiàn)。植物激素作為一類內(nèi)源調(diào)節(jié)因子，對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育具有重要意義。無(wú)論是促進(jìn)細(xì)胞及營(yíng)養(yǎng)器官伸長(zhǎng)生長(zhǎng)、促進(jìn)細(xì)胞分裂分化、誘導(dǎo)開(kāi)花結(jié)實(shí)等的生長(zhǎng)素，促進(jìn)細(xì)胞體積增大的細(xì)胞分裂素，促進(jìn)莖稈伸長(zhǎng)、抑制衰老的赤霉素，抑制生長(zhǎng)的脫落酸以及促進(jìn)衰老、打破休眠的乙烯，還是新確認(rèn)的油菜素內(nèi)酯、水楊酸、茉莉酸和多胺等，它們?cè)谡{(diào)節(jié)植物各種生理活動(dòng)時(shí)都不是單一發(fā)揮作用的，而是維持幾種激素之間的穩(wěn)態(tài)平衡，這其中包括協(xié)同作用、增效作用、拮抗作用等。例如，細(xì)胞分裂過(guò)程是IAA、CTK、GA三種激素協(xié)同作用的結(jié)果、GA對(duì)內(nèi)源IAA水平的調(diào)節(jié)作用以及IAA、CTK、GA與ABA之間的相互拮抗作用等。煙草花葉病毒（TMV）復(fù)制酶與擬南芥生長(zhǎng)素應(yīng)答基因調(diào)節(jié)因子PAP1/IAA26互作，超表達(dá)PAP1/IAA26的轉(zhuǎn)基因植株受到病毒侵染后不顯癥狀，而且病毒復(fù)制酶與植物生長(zhǎng)素應(yīng)答系統(tǒng)互作，從而誘導(dǎo)特定癥狀的產(chǎn)生（Padmanabhan等，2005）。許多研究已經(jīng)證實(shí)赤霉素在促進(jìn)植物生長(zhǎng)方面具有顯著作用，植物病毒與赤霉素合成過(guò)程關(guān)鍵酶互作是誘導(dǎo)矮化癥狀的重要原因，水稻矮縮病毒（RDV）的P2蛋白與內(nèi)根-貝殼杉烯氧化酶在體內(nèi)互作，干擾水稻體內(nèi)赤霉素的生物合成（Zhu等，2005）內(nèi)根-貝殼杉烯合成酶（Ent-kaurenesynthase,KS）催化赤霉素合成的第二步反應(yīng)，在赤霉素早期合成中極為重要，許多研究已經(jīng)證實(shí)該酶為赤霉素合成中的關(guān)鍵酶（Coram等，2010;Jackson等，2014;Zerbe等，2012）。另外，近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的新型植物激素油菜素甾醇等在植物生長(zhǎng)中突出作用而日益受到關(guān)注，相關(guān)研究通過(guò)蛋白組學(xué)以及VIGS技術(shù)揭示了油菜素甾醇、茉莉酸等增加棉花黃萎病抗性的機(jī)理（Gao等，2013），在病毒侵染過(guò)程中，油菜素甾醇一類物質(zhì)是否有增強(qiáng)植物抗病毒能力的作用，還需要進(jìn)一步研究和探討。本研究轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)以及后續(xù)的qPCR驗(yàn)證都表明，參與生長(zhǎng)素合成與運(yùn)輸?shù)纳L(zhǎng)素極性運(yùn)輸外流載體（Effluxcarrierofpolarauxintransport）、吲哚-3-甘油磷酸合酶（Indole-3-glycerolphosphatesynthase）以及參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)生長(zhǎng)素響應(yīng)因子10（Auxinresponsefactor10）、AUX/IAA蛋白（IAA8）基因表達(dá)均顯著下調(diào)，而抑制生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)的羥基肉桂酰輔酶A莽草酸/奎尼酸羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶（Hydroxycinnamoyl-CoAshikimate/quinatehydroxycinnamoyltransferase）基因表達(dá)上調(diào)；赤霉素合成關(guān)鍵酶內(nèi)根-貝殼杉烯合成酶（Ent-kaurenesynthase-like3），油菜素甾醇信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的富含亮氨酸重復(fù)序列（LRR）油菜素甾醇受體激酶（BrassinosteroidLRRreceptorkinase）基因顯著下調(diào)。WDV的侵染打破了促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育的這幾大類激素代謝的穩(wěn)態(tài)平衡，可能是導(dǎo)致小麥植株嚴(yán)重矮化的原因。2.3.2WDV誘導(dǎo)感病寄主分蘗異常的原因分析在田間，受WDV侵染的小麥植株，根部通?？梢?jiàn)眾多小分蘗的產(chǎn)生，表現(xiàn)為整株叢生，而葉部癥狀則呈現(xiàn)多樣化。本研究采用的WDV分離物來(lái)源于陜西韓城，其在溫室接種條件下，植株在發(fā)生分蘗前已死亡，葉部癥狀表現(xiàn)為心葉卷曲并有缺刻、早期葉脈黃綠相間，后期葉片黃化。30 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第二章小麥矮縮病毒侵染小麥的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及差異表達(dá)基因分析分蘗發(fā)生是小麥重要的農(nóng)藝性狀之一，分蘗過(guò)多或過(guò)少都會(huì)嚴(yán)重影響單產(chǎn)，植物激素在分蘗的發(fā)生與衰亡過(guò)程中起著關(guān)鍵的作用（Kariali等，2007）。小麥分蘗的發(fā)生與其內(nèi)源IAA和ZR+Z的含量尤其是二者間的比值密切相關(guān)，IAA/(ZR+Z)值低，利于分蘗的發(fā)生，高則不利于分蘗的發(fā)生。細(xì)胞分裂素不僅具有促進(jìn)細(xì)胞分裂和分化的作用，還能延遲蛋白質(zhì)和葉綠素的降解，抑制衰老。研究表明，細(xì)胞分裂素基因的引入和表達(dá)降低了煙草幼苗對(duì)煙草壞死病毒（Tobacconecrosisvirus,TNV）的易感性，提高了其氧化應(yīng)激的耐受性（Pogany等，2004）。受到馬鈴薯Y病毒（PotatovirusY,PVY）侵染后，在易感馬鈴薯品種中檢測(cè)到嘌呤環(huán)N9位葡糖基化細(xì)胞分裂素（Cytokinin-9-Glucosylation）含量有明顯的上升，在抗病品種中卻觀察不到這種現(xiàn)象，這表明PVY侵染以后誘導(dǎo)發(fā)生糖基化而造成細(xì)胞分裂素不可逆的失活（Dermastia等，1995）。本研究結(jié)果表明在WDV侵染后寄主小麥體內(nèi)催化細(xì)胞分裂素糖基化修飾導(dǎo)致其發(fā)生不可逆失活的細(xì)胞分裂素N-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶1（Cytokinin-N-glucosyltransferase1）以及促進(jìn)嘌呤類物質(zhì)運(yùn)輸?shù)泥堰释感悦?0（Purinepermease10）基因均上調(diào)表達(dá)。由此推測(cè)，病毒侵染以后寄主體內(nèi)細(xì)胞分裂素含量上升，是對(duì)抗病毒的一種應(yīng)激反應(yīng)，糖基化修飾酶相關(guān)基因的上調(diào)可能是由于病毒誘導(dǎo)產(chǎn)生，也可能是植物對(duì)體內(nèi)細(xì)胞分裂素過(guò)量的自我調(diào)節(jié)反應(yīng)。綜上所述，生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素的比例失調(diào)，還有ABA的參與，可能是導(dǎo)致感病小麥植株分蘗異常的原因。2.3.3WDV侵染對(duì)寄主光合作用的影響病毒的侵染常常造成植物重要的營(yíng)養(yǎng)器官葉片的黃化褪綠，使光合作用受到抑制，這依然是由于病毒致病因子與植物體內(nèi)相關(guān)蛋白互作造成的，CMV編碼的2b蛋白是病毒基因沉默抑制子，該蛋白會(huì)造成葉綠體畸形、抑制光合作用基因，從而造成黃化癥狀的產(chǎn)生，病毒2b突變體毒性減輕（Mochizuki等，2014）。其他研究也表明，病毒的侵染會(huì)破壞寄主植物葉綠體的超微結(jié)構(gòu)以及光合作用膜系統(tǒng)的正常運(yùn)行，從而導(dǎo)致葉綠素代謝的紊亂和光合作用中的關(guān)鍵酶的活性降低等等（Ryslava等，2003;Spoustova等，2013;Wilhelmova等，2005）。本研究中轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的驗(yàn)證結(jié)果顯示，WDV侵染導(dǎo)致小麥體內(nèi)光合作用關(guān)鍵酶RuBisCO大小亞基比例失調(diào)，RuBisCO活化酶基因表達(dá)下調(diào)，從而抑制了光合作用。參與葉綠素合成與分解代謝的原葉綠素酸酯氧化還原酶（Protochlorophyllidereductase）、紅色葉綠素代謝產(chǎn)物還原酶（Redchlorophyllcatabolitereductase)基因表達(dá)均上調(diào)，這說(shuō)明葉綠素代謝是一個(gè)錯(cuò)綜復(fù)雜的過(guò)程，是由多個(gè)基因共同調(diào)控的結(jié)果。葉綠體前體中的碳酸酐酶（Carbonicanhydrase,chloroplastprecursor）及非綠質(zhì)體葉綠體前體中的磷酸丙糖/磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Triosephosphate/phosphatetranslocator,non-greenplastid,chloroplastprecursor）及捕光色素蛋白復(fù)合體I結(jié)合蛋白（LHCItypeIVchlorophyllbindingprotein）等基因表達(dá)量上升，可能是植物光合作用補(bǔ)救和光保護(hù)作用的一種表現(xiàn)。2.3.4WDV侵染以后寄主防御機(jī)制的啟動(dòng)本研究還關(guān)注了植物抵抗病毒防御機(jī)制中的的抗氧化系統(tǒng)、水楊酸途徑、基因沉默途徑及一些抗病相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子等在病毒侵染后的差異表達(dá)變化，研究表明在植物中表達(dá)SOD、谷胱甘肽等一類抗氧化物質(zhì)相關(guān)基因，可以使其有效抵御氧化壓力等刺激帶來(lái)的傷害（Lim等，2007;Strohm31 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第二章小麥矮縮病毒侵染小麥的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及差異表達(dá)基因分析等，2002）?；虺聊侵参镉脕?lái)抵抗外源核酸的入侵一種重要手段，用于調(diào)節(jié)基因在時(shí)間和空間上的表達(dá)，利用RNAi技術(shù)培育轉(zhuǎn)基因抗病毒植株是目前病毒防治的有效方法，基因沉默中相關(guān)基因的表達(dá)對(duì)于植物抵抗病毒的侵染具有重要意義（Aliyari等，2008;Ding等，2007）。AGO（Argonaute）蛋白家族參與所有已知的小RNA沉默途徑，對(duì)形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RISC）具有決定作用。編碼AGO蛋白家族的基因數(shù)量和表達(dá)模式在不同的物種有很大差別，在同一物種中，AGO基因家族成員調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的許多不同的代謝通路，并且調(diào)控策略也存在差異。本研究結(jié)果表明，WDV侵染以后寄主抗氧化系統(tǒng)中的超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）等基因表達(dá)下調(diào)，這不利于寄主體內(nèi)活性氧等氧化物質(zhì)的清除。AGO4基因表達(dá)上調(diào)說(shuō)明被侵染植物體內(nèi)可能啟動(dòng)了抵抗病毒的基因沉默途徑。轉(zhuǎn)錄因子WRKYDNA結(jié)合蛋白70（WRKYDNA-bindingprotein70）基因表達(dá)上調(diào)，該類轉(zhuǎn)錄因子被認(rèn)為是水楊酸信號(hào)通路中的重要的調(diào)節(jié)因子，而對(duì)茉莉酸途徑卻起到的是負(fù)調(diào)節(jié)作用，這說(shuō)明，病毒侵染以后寄主植物通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)作用啟動(dòng)了抗病代謝通路中水楊酸途徑，對(duì)水楊酸信號(hào)響應(yīng)的細(xì)胞壁相關(guān)激酶（Wall-associatedkinase2）在細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞壁與細(xì)胞質(zhì)之間的通訊等方面中起重要作用，在病毒侵染后下調(diào)表達(dá)。綜合分析，病毒破壞了寄主體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)等主要的防御體系，雖然寄主植物也啟動(dòng)了諸如基因沉默、抗病代謝途徑等來(lái)抵御，但最終還是在這場(chǎng)博弈中敗下陣來(lái)。32 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第三章小麥矮縮病毒侵染誘導(dǎo)寄主miRNA差異表達(dá)的初步分析第三章小麥矮縮病毒侵染誘導(dǎo)寄主miRNA差異表達(dá)的初步分析miRNA在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用，主要是通過(guò)抑制靶mRNA轉(zhuǎn)錄、翻譯或?qū)衜RNA剪切并促進(jìn)其降解來(lái)發(fā)揮功能。本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)寄主植物小麥體內(nèi)的miRNA表達(dá)情況進(jìn)行初步研究，通過(guò)比較WDV侵染誘導(dǎo)小麥體內(nèi)miRNA的表達(dá)差異，來(lái)探究病毒是如何通過(guò)影響寄主miRNA的正常表達(dá)，從而干擾植物正常生理過(guò)程的致病分子機(jī)制。對(duì)差異表達(dá)的miRNA靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，尋找與寄主病程相關(guān)的基因，從而根據(jù)miRNA調(diào)控植物防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān)基因的機(jī)制，解析植物免疫途徑的發(fā)生過(guò)程。由于無(wú)法獲得小麥的全基因組信息，因此本研究只能通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的小麥的miRNA信息作為參考來(lái)進(jìn)行初步分析，未能對(duì)新的miRNA進(jìn)行預(yù)測(cè)。3.1材料與方法3.1.1材料本研究用于miRNA高通量測(cè)序分析的材料與小麥轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析的相同，相關(guān)內(nèi)容參見(jiàn)第二章。3.1.2方法3.1.2.1miRNA測(cè)序原始數(shù)據(jù)處理（1）測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)（RawReads）分別進(jìn)行過(guò)濾，將得到的有效數(shù)據(jù)（Cleanreads）mapping到小麥miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)，所得的mappedreads就是有效測(cè)序量。（2）利用國(guó)際精確算法Counts進(jìn)行miRNA表達(dá)定量，計(jì)算出各個(gè)樣本的miRNA表達(dá)量。3.1.2.2miRNA生物信息分析過(guò)程（1）用EB-Seq對(duì)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組進(jìn)行比較，篩選得到差異基因及差異miRNA，篩選的標(biāo)準(zhǔn)為log2FC>1或log2FC<-1，P-value<0.05，F(xiàn)DR<0.05。（2）對(duì)差異miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)。（3）以靶基因?yàn)槠鹾宵c(diǎn)對(duì)差異基因與差異miRNA進(jìn)行負(fù)相關(guān)聯(lián)合分析。（4）根據(jù)負(fù)相關(guān)分析結(jié)果，構(gòu)建miRNA與靶基因調(diào)控關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。3.2結(jié)果與分析3.2.1miRNA表達(dá)量的計(jì)算及差異表達(dá)miRNA的篩選將miRNA測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾后，利用BWA軟件比對(duì)到小麥miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)，共獲得119條已知成熟miRNA的表達(dá)量，用PMMR顯示出來(lái)。利用EB-Seq算法，基于miRNA的Counts計(jì)算兩組樣品之間miRNA表達(dá)的差異性，按照上述方法中的篩選標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)測(cè)序得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行差異表達(dá)分析，如表3.1所示，共獲得了10條顯著差異表達(dá)的miRNA，其中上調(diào)表達(dá)的有2個(gè)，下調(diào)表達(dá)的有8個(gè)。33 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第三章小麥矮縮病毒侵染誘導(dǎo)寄主miRNA差異表達(dá)的初步分析表3.1顯著差異表達(dá)的miRNATable3.1DifferentiallyexpressedmiRNAPre-miRNAAccIDmiRNASequenceLogStyle2FCFDRNametae-miR171btae-MIR171bttgagccgtgccaatatcacg-1.4110.04636down-regulatedtae-miR5384-3ptae-MIR5384tgagcgcgccgccgtcgaatg-1.5802.614E-06down-regulatedtae-miR531tae-MIR531cgctcgccggagcagcgtgca-1.8007.921E-10down-regulatedtae-miR160tae-MIR160tgcctggctccctgtatgcca-1.0870.002505down-regulatedtae-miR9653btae-MIR9653btggccaaggtctcttgaggct-1.2024.836E-04down-regulatedtae-miR397-5ptae-MIR397tcaccggcgctgcacacaatg1.0020.02029up-regulatedtae-miR1123tae-MIR1123tccgtgagacctggtctcataga-1.7401.293E-08down-regulatedtae-miR169tae-MIR169gggcaagtcaccctgggctacc-3.5460down-regulatedtae-miR9774tae-MIR9774caagatattgggtatttctgtc-1.5093.529E-07down-regulatedtae-miR2275-3ptae-MIR2275tttggtttcctccaatatctcg2.4194.804E-11up-regulated3.2.2差異表達(dá)miRNA的靶基因預(yù)測(cè)植物體內(nèi)成熟的miRNA是由較長(zhǎng)的初級(jí)轉(zhuǎn)錄物經(jīng)過(guò)核酸酶剪切加工而產(chǎn)生，然后組裝進(jìn)RISC（RNA誘導(dǎo)的基因沉默復(fù)合體）中，通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式識(shí)別靶基因，并且根據(jù)互補(bǔ)程度引導(dǎo)RISC執(zhí)行抑制靶mRNA的翻譯或者促進(jìn)靶mRNA的降解的功能。以顯著差異表達(dá)的miRNA為研究對(duì)象，利用psTarget進(jìn)行靶基因的預(yù)測(cè)。從表3.2分析可知，同一個(gè)miRNA可以有多個(gè)不同代謝通路上的靶標(biāo)基因，tae-miR160的靶標(biāo)基因是生長(zhǎng)素響應(yīng)因子、微管蛋白折疊輔因子、鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)子；tae-miR9653b的靶標(biāo)基因有生長(zhǎng)素響應(yīng)因子、脂氧合酶；tae-miR397-5p的靶標(biāo)基因是水解酶及轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白；tae-miR5384-3p的靶標(biāo)基因是細(xì)胞色素P450；tae-miR531的靶標(biāo)與液泡以及液泡膜蛋白相關(guān)。此外，比較值得一提的是，tae-miR9774以及tae-miR2275-3p的靶標(biāo)基因涉及到一些植物抗病相關(guān)蛋白，而且這兩種miRNA的表達(dá)差異趨勢(shì)并不一致，這說(shuō)明miRNA對(duì)靶標(biāo)基因的調(diào)控作用是一個(gè)相對(duì)復(fù)雜的過(guò)程，可能涉及到更多的調(diào)控因子的參與。34 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第三章小麥矮縮病毒侵染誘導(dǎo)寄主miRNA差異表達(dá)的初步分析表3.2差異表達(dá)miRNA的靶基因預(yù)測(cè)Table3.2PredictedtargetofdifferentiallyexpressedmiRNAAccIDPredictedTargetmiRNA_aligned_fragmentInhibitiontae-miR5384-3pCytochromeP450familyproteinUGAGCGCGCCGCCGUCGAAUGTranslationFACTcomplexsubunitSPT16UGAGCGCGCCGCCGUCGAAUGTranslationtae-miR531Vacuolarprotein-sortingprotein45CGCUCGCCGGAGCAGCGUGCCleavageTonoplastmembraneintegralCGCUCGCCGGAGCAGCGUGCTranslationproteinZmTIP3-1tae-miR160Auxinresponsefactor16UGCCUGGCUCCCUGUAUGCCCleavageTubulinfoldingcofactorUGCCUGGCUCCCUGUAUGCCACleavagePotassiumtransporterUGCCUGGCUCCCUGUAUGCCCleavagetae-miR9653bLipoxygenase3UGGCCAAGGUCUCUUGAGGCUTranslationAuxinresponsefactor6UGGCCAAGGUCUCUUGAGGCUCleavagetae-miR397-5pHydrolaseUCACCGGCGCUGCACACAAUCleavageTransducinfamilyproteinUCACCGGCGCUGCACACAAUCleavageRubberelongationfactorfamilytae-miR1123UCCGUGAGACCUGGUCUCAUAGATranslationproteintae-miR169UnknownproteinGGGCAAGUCACCCUGGGCUATranslationtae-miR9774SNF1-relatedproteinkinaseCAAGAUAUUGGGUAUUUCUGCleavageNB-ARCdomain-containingCAAGAUAUUGGGUAUUUCUGCleavagediseaseresistanceproteinUbiquitin-likemodifier(SUMO)CAAGAUAUUGGGUAUUUCUGTranslationE3ligaseThiol-activatedcytolysinfamilytae-miR2275-3pUUUGGUUUCCUCCAAUAUCUCGTranslationproteinTransposableelementgeneUUUGGUUUCCUCCAAUAUCUCGCleavagePentatricopeptiderepeatUUUGGUUUCCUCCAAUAUCUTranslationResistanceproteincandidateUUUGGUUUCCUCCAAUAUCUCleavage35 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第三章小麥矮縮病毒侵染誘導(dǎo)寄主miRNA差異表達(dá)的初步分析3.2.3差異基因與差異miRNA的負(fù)相關(guān)聯(lián)合分析以靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果為契合點(diǎn)，對(duì)miRNA與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的mRNA差異分析結(jié)果進(jìn)行負(fù)相關(guān)聯(lián)合分析。利用miRNA對(duì)于預(yù)測(cè)得到靶基因的負(fù)調(diào)控作用，即miRNA差異上調(diào)，其相應(yīng)靶基因差異下調(diào)，miRNA差異下調(diào)，其相應(yīng)靶基因差異上調(diào)，之后對(duì)負(fù)相關(guān)分析的基因進(jìn)行GO功能注釋。從表3.3中分析結(jié)果表明，tae-miR1123負(fù)調(diào)控的靶標(biāo)指向橡膠延伸因子蛋白家族[Rubberelongationfactorfamilyprotein(REF)]和另一未知基因，相關(guān)研究表明，REF具有淀粉樣蛋白特性，不僅與天然橡膠的合成及凝固有關(guān)，還參與植物防衛(wèi)反應(yīng)及壓力應(yīng)激反應(yīng)（Berthelot等，2012）。tae-miR5384-3p的靶基因是FACTcomplexsubunitSPT16和細(xì)胞色素P450蛋白家族（CytochromeP450familyprotein，CYP450），2013年MariaHondele等在Nature發(fā)表文章指出，組蛋白伴侶FACT識(shí)別組蛋白H2A和H2B，在轉(zhuǎn)錄、復(fù)制和DNA修復(fù)過(guò)程中有重要作用，F(xiàn)ACT的Spt16M伴侶區(qū)域與H2A-H2B二聚物之間可以形成復(fù)合物，Spt16M會(huì)阻斷H2B與DNA的相互作用，這有利于解釋FACT使核小體失去穩(wěn)定性的原因（Hondele等，2013）。眾所周知，植物CYP450在植物激素、甾醇、黃酮類、萜類等生物合成中發(fā)揮重要作用，還參與外源化合物的代謝解毒；tae-miR2275-3p的靶標(biāo)指向轉(zhuǎn)座子基因和三角狀五肽重復(fù)蛋白（Pentatricopeptiderepeat，PPR），PPR在水稻中由YSA編碼，在幼葉和莖稈中高表達(dá)，其表達(dá)受光調(diào)節(jié)，突變體ysa在3葉期以前出現(xiàn)白化葉片，之后逐漸變綠，到6葉期完全恢復(fù)到正常綠色，分析表明突變體葉色的改變是由于葉綠素含量以及葉綠體發(fā)育的變化造成的（Su等，2012）；tae-miR160的靶標(biāo)基因?yàn)楦哂H和性鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Highaffinitypotassiumtransporter）；tae-miR9774的靶標(biāo)基因?yàn)楹蠳B-ARC結(jié)構(gòu)域的抗病相關(guān)蛋白（NB-ARCdomain-containingdiseaseresistanceprotein），該蛋白參與細(xì)胞凋亡及防衛(wèi)反應(yīng)。表3.3顯著差異表達(dá)的miRNA與差異基因聯(lián)合分析Table3.1ConjointanalysisofdifferentiallyexpressedmiRNAandtargetgenesmiRNA-AccIDLog2FCFDRmiRNA-StylePredictedTargetLog2FCFDRmRNA-Styletae-miR1123-1.7401.293E-08down-regulatedUnknownprotein2.4420.02414up-regulatedRubberelongationfactortae-miR1123-1.7401.293E-08down-regulated2.2500.005811up-regulatedfamilyproteinCytochromeP450familytae-miR5384-3p-1.5802.614E-06down-regulated2.9471.328E-13up-regulatedproteinFACTcomplexsubunittae-miR5384-3p-1.5802.614E-06down-regulated3.0880.0002921up-regulatedSPT16tae-miR2275-3p2.4194.804E-11up-regulatedTransposableelementgene-3.5798.575E-13down-regulatedtae-miR2275-3p2.4194.804E-11up-regulatedPentatricopeptiderepeat-1.5840.04964down-regulatedtae-miR160-1.0870.002505down-regulatedPotassiumtransporter1.9910.03173up-regulatedNB-ARCdomain-containingtae-miR9774-1.5093.529E-07down-regulated4.9691.777E-06up-regulateddiseaseresistanceprotein36 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第三章小麥矮縮病毒侵染誘導(dǎo)寄主miRNA差異表達(dá)的初步分析3.2.4miRNA調(diào)控靶基因的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建為了更直觀地了解miRNA調(diào)控靶基因相關(guān)關(guān)系，對(duì)差異基因與差異miRNA負(fù)相關(guān)聯(lián)合分析結(jié)果進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，見(jiàn)圖3.1。圖3.1miRNA調(diào)控靶基因網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建Fig.3.1miRNATargetNetwork注：紅色表示上調(diào)表達(dá)，綠色表示下調(diào)表達(dá)，表示負(fù)調(diào)節(jié)作用3.3總結(jié)與討論本研究利用RNA-Seq高通量測(cè)序技術(shù)，分析了WDV侵染下小麥體內(nèi)miRNA的差異表達(dá)情況，獲得了119條已知miRNA的表達(dá)量，經(jīng)差異表達(dá)分析后得到了10條顯著差異表達(dá)的miRNA。靶基因的預(yù)測(cè)以及GO功能注釋的結(jié)果表明，這些受到miRNA調(diào)控的靶標(biāo)基因基因主要是生長(zhǎng)素響應(yīng)因子、微管蛋白折疊輔因子、鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)子、脂氧合酶、水解酶、轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白、細(xì)胞色素P450、液泡以及液泡膜蛋白，還有一些植物抗病相關(guān)蛋白等。以靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果為契合點(diǎn)，對(duì)miRNA與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中mRNA差異分析結(jié)果進(jìn)行了負(fù)相關(guān)聯(lián)合分析，結(jié)果獲得了一些重要的調(diào)控信息。例如，受tae-miR5384-3p調(diào)控的FACTcomplexsubunitSPT16在轉(zhuǎn)錄、復(fù)制以及DNA修復(fù)方面發(fā)揮重要作用，CYP450在生物合成以及代謝解毒中發(fā)揮重要作用；受tae-miR2275-3p調(diào)控的三角狀五肽重復(fù)蛋白（Pentatricopeptiderepeat，PPR），與植物葉片內(nèi)葉綠素含量以及葉綠體發(fā)育過(guò)程密切相關(guān)，該miRNA還參與調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)座子基因的表達(dá)；受tae-miR1123調(diào)控的Rubberelongationfactor（REF）與植物防衛(wèi)反應(yīng)及壓力應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。WDV誘導(dǎo)寄主小麥miRNA差異表達(dá)分析，反映出植物受到病毒侵染以后生理活動(dòng)的變化過(guò)程，同時(shí)也為解析病毒致病的分子機(jī)制提供重要參考。tae-miR160的靶標(biāo)基因?yàn)楦哂H和性鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Highaffinitypotassiumtransporter），鉀元素有助于提高植物抗逆性，還能夠改善光合作用、調(diào)節(jié)植物激素水平，防止早衰；tae-miR9774的靶標(biāo)基因?yàn)楹蠳B-ARC結(jié)構(gòu)域的抗病相關(guān)蛋白37 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第三章小麥矮縮病毒侵染誘導(dǎo)寄主miRNA差異表達(dá)的初步分析（NB-ARCdomain-containingdiseaseresistanceprotein），該蛋白不僅參與細(xì)胞凋亡，還參與植物的一系列防衛(wèi)反應(yīng)。需要特別說(shuō)明的是，本章對(duì)小麥矮縮病毒侵染誘導(dǎo)寄主miRNA的差異表達(dá)進(jìn)行了初步分析，后續(xù)工作還包括新的miRNA預(yù)測(cè)以及Northernblot等實(shí)驗(yàn)證據(jù)的完善和補(bǔ)充。38 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第四章小麥矮縮病毒中國(guó)分離物侵染性克隆的構(gòu)建第四章小麥矮縮病毒中國(guó)分離物侵染性克隆的構(gòu)建病毒致病因子通過(guò)與寄主植物代謝通路上的蛋白互作，干擾植物基因正常表達(dá)，從而改變植物正常的生理生化過(guò)程，上一章通過(guò)RNA-Seq深度測(cè)序技術(shù)對(duì)WDV侵染導(dǎo)致的轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)情況進(jìn)行分析，為揭示病毒致病機(jī)理提供依據(jù)和新的思路。侵染性克隆是研究植物病毒致病分子機(jī)制、構(gòu)建病毒過(guò)量表達(dá)載體和病毒誘導(dǎo)的基因沉默載體的重要研究工具。為了進(jìn)一步研究WDV的致病性，本章試圖構(gòu)建小麥矮縮病毒中國(guó)分離物的侵染性克隆，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法在適生寄主小麥上建立侵染體系，并通過(guò)癥狀觀察法、PCR法、介體傳毒法等對(duì)其侵染性進(jìn)行驗(yàn)證。4.1材料與方法4.1.1材料4.1.1.1毒源與植物材料WDV病毒分離物和傳毒介體異沙葉蟬均來(lái)源于陜西韓城，由本實(shí)驗(yàn)室在高感小麥矮縮病的小麥品種揚(yáng)麥12號(hào)上繁殖與飼養(yǎng)。4.1.1.2菌株、載體及試劑大腸桿菌(Escherichiacoli)感受態(tài)DH5α購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株EHA105、植物雙元表達(dá)載體pLH9000均由本實(shí)驗(yàn)室保存，中間克隆載體pGEM?-TEasyVectorSystems、T4DNA連接酶、Wizard?SVGelandPCRClean-UpSystem購(gòu)自Promega公司，限制性內(nèi)切酶購(gòu)自NEB公司，ExTaq?、rTaq酶、dNTPs、DNAMarker等購(gòu)自TaKaRa公司，illustra?TempliPhi?100AmplificationKit購(gòu)自GEHealthcare公司，F(xiàn)astAPThermosensitiveAlkalinePhosphatase購(gòu)自ThermoScientific公司，其它試劑均購(gòu)自國(guó)內(nèi)生化試劑廠商。4.1.2方法4.1.2.1CTAB法提取小麥葉片總DNA將采自陜西韓城等生態(tài)區(qū)的小麥矮縮病樣品，按照經(jīng)典的CTAB法提取小麥葉片總DNA，用于WDV的檢測(cè)，常規(guī)PCR檢測(cè)所用的引物信息見(jiàn)附錄。（1）取小麥葉片0.1g，加液氮充分研磨后移入2ml滅菌離心管；（2）向樣品粉末中加入900μlCTAB裂解液，65℃溫浴1h，期間不時(shí)地顛倒混勻4-5次；（3）取出后置于冰上冷卻5min，加入500μl氯仿：異戊醇（24：1）混合物，渦旋混勻；（4）冷凍離心機(jī)中以12000rpm，4℃，離心15min；（5）小心吸取600μl上清液，置于新的1.5ml滅菌離心管中，加入8μlRNase(10mg/ml)，輕輕渦旋混勻，37℃放置2h；（6）加入1/10體積3M醋酸鈉與等體積的異丙醇，輕輕混勻，-20℃靜置30min以上；（7）冷凍離心機(jī)中以12000rpm，4℃，離心15min；（8）棄上清，向沉淀加入1ml預(yù)冷的70%無(wú)水乙醇小心洗滌，重復(fù)2次；39 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第四章小麥矮縮病毒中國(guó)分離物侵染性克隆的構(gòu)建（9）冷凍離心機(jī)中以12000rpm，4℃，離心10min；（10）棄上清，真空干燥儀中干燥沉淀，加入40-60μl滅菌ddH2O溶解，-20℃保存?zhèn)溆?。?.1CTAB裂解液Table4.1CTABlysisbuffer試劑加入量終濃度1MTris-HCl（pH8.0）10ml100mM0.5MEDTA（pH8.0）4ml20mM5MNaCl（pH8.0）28ml1.4MCTAB2g2%（wv）滅菌ddH2O至總體積100ml4.1.2.2PCR反應(yīng)體系10×PCRBuffer2.5μldNTP2.0μlPrimer5′（5μM）1.0μlPrimer3′（5μM）1.0μlDNA聚合酶0.2μlDNA1.0μlddH2O17.3μl總體積25.0μl上述混合溶液置于入PCR儀中擴(kuò)增，反應(yīng)條件如下所示。反應(yīng)結(jié)束后，取適量加入LoadingBuffer的PCR產(chǎn)物，1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。95℃預(yù)變性4min95℃變性30s溫度視引物而定退火45s34個(gè)循環(huán)72℃延伸1min72℃再延伸10min10℃保存4.1.2.3PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的回收、連接及轉(zhuǎn)化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的回收純化按照Wizard?SVGelandPCRClean-UpSystem說(shuō)明書(shū)進(jìn)行：（1）PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后切膠，將膠塊置于1.5ml滅菌離心管中，按1：1加入溶膠液，65℃放置10min直至膠塊完全溶解；40 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第四章小麥矮縮病毒中國(guó)分離物侵染性克隆的構(gòu)建（2）回收柱放入收集管中，將溶膠混合液完全加入柱中，室溫靜置1min；（3）12000rpm離心1min，棄廢液，重新將柱子放回收集管中；（4）加入700μl洗膜液，12000rpm離心1min，棄廢液，重新將柱子放回收集管中；（5）加入500μl洗膜液，12000rpm離心1min，棄廢液，重新將柱子放回收集管中；（6）12000rpm離心2min，至酒精揮發(fā)；（7）將柱子轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，加入50μl滅菌ddH2O后室溫靜置1min；（8）12000rpm離心1min，棄柱子，回收產(chǎn)物于-20℃保存?zhèn)溆?。PCR回收產(chǎn)物的連接按照pGEM?-TEasyVectorSystems的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。本研究采用熱激法進(jìn)行連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌的操作，步驟如下：（1）10μl連接產(chǎn)物加入到50μl感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻；（2）冰浴30min，42℃熱激45s-90s，冰浴2min；（3）向離心管中加入500μl液體LB培養(yǎng)基，37℃，200rpm搖培1h；（4）將100-200μl菌液涂布于含有氨芐青霉素的LB固體平板上；（5）37℃，培養(yǎng)10h左右。4.1.2.4質(zhì)粒提取及酶切體系大腸桿菌質(zhì)粒提取按照Axygen公司的質(zhì)粒小提試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，重組質(zhì)粒需要經(jīng)過(guò)酶切鑒定，體系如下：10×CutSmartBuffer5.0μl限制性內(nèi)切酶1.0μl質(zhì)粒DNA2.0μgddH2O加至總體積50.0μl4.1.2.5載體構(gòu)建策略利用雙元植物表達(dá)載體pLH9000（圖4.1），將1.42倍正向串聯(lián)重復(fù)的WDV序列連入表達(dá)載體，主要分為以下步驟：（1）含有WDV-LIR（長(zhǎng)基因間隔區(qū)）短片段病毒序列的克隆，長(zhǎng)度為WDV全長(zhǎng)的0.42倍；（2）將病毒短序列連入雙元表達(dá)載體pLH9000多克隆位點(diǎn)，獲得重組質(zhì)粒pLH9000-0.42V；（3）滾環(huán)擴(kuò)增獲得WDV全長(zhǎng)序列；（4）將線性化的WDV全長(zhǎng)序列連入重組質(zhì)粒pLH9000-0.42V中；（5）篩選獲得具有正確插入取向的重組表達(dá)載體pLH9000-1.42V。41 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第四章小麥矮縮病毒中國(guó)分離物侵染性克隆的構(gòu)建圖4.1pLH9000載體示意圖Fig.4.1SketchmapofpLH9000vector4.1.2.5.1重組質(zhì)粒pLH9000-0.42V的獲得以WDV陽(yáng)性材料的DNA為模板，利用ExTaq?高保真酶，以0.4V-HindIII-F與0.4V-BamHI-R為引物（見(jiàn)附錄），擴(kuò)增包含病毒LIR（長(zhǎng)基因間隔區(qū)）的短片段，稱為0.42V，此片段在原病毒序列3′引入BamHI酶切位點(diǎn)，以便于重組載體的構(gòu)建。將該片段回收后連入中間克隆載體pGEM?-TEasyVector，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后篩選并提取陽(yáng)性質(zhì)粒，BamHI和HindIII雙酶切上述重組克隆載體，獲得具有雙酶切位點(diǎn)的插入片段。將上述片段回收純化后插入同樣BamHI和HindIII雙酶切的雙元植物表達(dá)載體pLH9000中，獲得陽(yáng)性重組質(zhì)粒pLH9000-0.42V。4.1.2.5.2侵染性克隆表達(dá)載體pLH9000-1.42V的獲得以WDV病毒基因組DNA為模板，利用illustra?TempliPhi?100AmplificationKit擴(kuò)增得到1倍全長(zhǎng)的病毒序列，HindIII將滾環(huán)復(fù)制得到的擴(kuò)增產(chǎn)物線性化，線性化后的WDV全長(zhǎng)序列與同樣單酶切的并經(jīng)去磷酸化處理的pLH9000-0.42V重組載體進(jìn)行連接。由于這一步是單酶切策略構(gòu)建載體，因此插入片段具有正反兩個(gè)插入取向，為此本研究設(shè)計(jì)了一對(duì)插入取向檢測(cè)引物（引物Orient-F與Orient-R），引物設(shè)計(jì)原則是：下游引物包含載體（短插入片段一側(cè)）部分序列，上游引物設(shè)計(jì)在長(zhǎng)插入片段內(nèi)部，如果WDV全長(zhǎng)序列插入方向正確，通過(guò)PCR反應(yīng)便可得到2100bp的擴(kuò)增片段，如果插入序列方向相反或未成功插入載體中，則不能擴(kuò)增產(chǎn)生片段。如此一來(lái)就可以得到含有1.42個(gè)病毒正向串聯(lián)重復(fù)序列結(jié)構(gòu)的侵染性克隆表達(dá)載體pLH9000-1.42V，見(jiàn)圖4.2。42 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第四章小麥矮縮病毒中國(guó)分離物侵染性克隆的構(gòu)建圖4.2插入取向檢測(cè)引物設(shè)計(jì)示意圖Fig.4.2Designmentofprimerstocheckinsertorientation滾環(huán)擴(kuò)增的具體操作步驟如下：（1）取1μlDNA模板加入到5μl樣品緩沖液中；（2）上述混合液于95℃加入變性3min，立即置于冰上冷卻；（3）向體系中加入5μl反應(yīng)緩沖液及0.2μl酶混合物，輕輕混勻；（4）30℃條件下反應(yīng)18h，65℃放置10min終止反應(yīng)；（5）獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物于-20℃保存?zhèn)溆?。線性化質(zhì)粒末端去磷酸化的操作步驟如下：（1）按照以下方法配制預(yù)混液：LinearDNA1.0μg10×reactionbuffer2.0μlFastAPThermosensitiveAlkalinePhosphatase1.0μlddH2O至20.0μl（2）輕輕混勻，于37℃孵育10min；（3）75℃放置5min終止反應(yīng)。4.1.2.6農(nóng)桿菌感受態(tài)制備及質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備按照以下步驟操作：（1）將農(nóng)桿菌單菌落接于1mlLB液體培養(yǎng)基中（含25μg/ml利福平），28℃搖培過(guò)夜；（2）取適量菌液接于50mlLB液體培養(yǎng)基中（含25μg/ml利福平），28℃搖培至OD600達(dá)到0.5；（3）4000rpm離心10min收集菌體，棄上清；（4）向菌體中加入30ml0.15mol/LNaCl，充分懸浮細(xì)胞后冰浴30min；（5）冷凍離心機(jī)中以4000rpm，4℃離心10min，棄上清；（6）向菌體中加入1ml預(yù)冷的含有15%甘油的20mmol/LCaCl2溶液，輕輕懸浮細(xì)胞；（7）分裝制備感受態(tài)細(xì)胞，液氮速凍后置于-80℃保存?zhèn)溆?。采用凍融法將重組質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，具體步驟如下：（1）將1μl質(zhì)粒加入到100μl農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻；43 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第四章小麥矮縮病毒中國(guó)分離物侵染性克隆的構(gòu)建（2）冰浴30min后于液氮中速凍1min，30℃放置5min；（3）加入400μl液體LB培養(yǎng)基，28℃搖培4h；（4）將100μl菌液涂布于LB固體平板培養(yǎng)基上（含25μg/ml利福平與100μg/ml卡那霉素）；（5）28℃培養(yǎng)36h左右，用菌落PCR法鑒定出陽(yáng)性菌落；（6）陽(yáng)性菌落劃線可以保存1個(gè)月左右。4.1.2.7農(nóng)桿菌介導(dǎo)的WDV適生寄主（小麥）侵染體系的建立將構(gòu)建在植物表達(dá)載體上的WDV侵染性克隆表達(dá)載體通過(guò)凍融法導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞中。將陽(yáng)性菌落在含有卡那霉素與利福平的固體平板上劃線培養(yǎng)2天，備用。采用固體菌落針刺法對(duì)高感小麥矮縮病的揚(yáng)麥12號(hào)初萌發(fā)的小麥種子進(jìn)行刺傷接種，具體做法是：用抹刀刮取適量菌體在胚部或胚部附近涂抹均勻，以昆蟲(chóng)針按不同角度針刺3~4次，接種后的小麥種子于28℃暗培養(yǎng)24h，轉(zhuǎn)入18-22℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，光照時(shí)間16h，每批接種80~100株，觀察接種材料發(fā)病情況。同時(shí)，以含有pLH9000空載體的農(nóng)桿菌接種作為陰性對(duì)照。4.1.2.8病毒侵染活性驗(yàn)證對(duì)于侵染性克隆接種后的適生寄主小麥，采用PCR法檢測(cè)病毒、并用介體傳毒法方法驗(yàn)證病毒生物學(xué)活性。介體傳毒方法主要是利用具有典型癥狀的小麥病株對(duì)無(wú)毒異沙葉蟬進(jìn)行飼毒，3天后將介體昆蟲(chóng)轉(zhuǎn)移至一心一葉的健康小麥植株上，觀察植株的癥狀表現(xiàn)。4.2結(jié)果與分析4.2.1侵染性克隆表達(dá)載體的構(gòu)建4.2.1.1重組質(zhì)粒pLH9000-0.42V的構(gòu)建及酶切鑒定利用BamHI與HindIII兩個(gè)限制酶，從連接了0.42V短片段的重組質(zhì)粒pGEM-T-0.42V上，雙酶切獲得含有兩個(gè)不同黏性末端的序列片段。將0.42V短片段連接到同樣雙酶切的表達(dá)載體pLH9000上，即重組質(zhì)粒pLH9000-0.42V的獲得同樣需要進(jìn)行酶切鑒定。從圖4.3（A）可以看出，以WDV陽(yáng)性材料DNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得了兩端具有HindIII與BamHI酶切位點(diǎn)的短序列片段0.42V，經(jīng)T-A克隆后送生工生物工程有限公司測(cè)序，序列比對(duì)顯示與原始序列完全一致。圖4.3（B）表明利用HindIII與BamHI雙酶切重組載體pGEM-T-0.42V，獲得了長(zhǎng)度為1150bp的兩端含有不同黏性末端的DNA短片段。圖4.3（C）表示利用HindIII與BamHI雙酶切鑒定重組載體pLH9000-0.42V，重新獲得了9120bp的空載體與長(zhǎng)度為1150bp的插入片段，說(shuō)明插入片段已經(jīng)成功連入到了表達(dá)載體中（圖4.4）。44 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第四章小麥矮縮病毒中國(guó)分離物侵染性克隆的構(gòu)建(A)(B)(C)圖4.3重組質(zhì)粒pLH9000-0.42V的構(gòu)建及酶切鑒定Fig.4.3ConstructionofrecombinantplasmidpLH9000-0.42Vanditsidentificationbyrestrictionenzymedigestion(A)M：DL2000Marker；泳道1-2：PCR擴(kuò)增獲得的WDV短片段0.42V(B)M：DL5000Marker；泳道1-2：重組質(zhì)粒pGEM-T-0.42V雙酶切圖(C)M：DL15000Marker；泳道1：質(zhì)粒pLH9000雙酶切圖；泳道2：WDV短片段0.42V；泳道3：重組質(zhì)粒pLH9000-0.42V酶切鑒定圖；(A)M:DL2000Marker;Lane1-2:PCRampliconofWDVnamed0.42V(B)M:DL5000Marker;Lane1-2:RestrictionenzymedigestionofrecombinantplasmidpGEM-T-0.42V(C)M:DL15000Marker;Lane1:RestrictionenzymedigestionofpLH9000;Lane2:PCRampliconofWDVnamed0.42V;Lane3:RestrictionenzymedigestionofrecombinantplasmidpLH9000-0.42V圖4.4pLH9000-0.42V載體示意圖Fig.4.4SketchmapofpLH9000-0.42Vvector4.2.1.2植物表達(dá)載體pLH9000-1.42V的初步構(gòu)建以WDV病毒環(huán)狀DNA為模板通過(guò)滾環(huán)擴(kuò)增（RCA）得到的產(chǎn)物是高分子量的線性雙鏈，是加入模板即WDV全長(zhǎng)序列的串聯(lián)重復(fù)拷貝，利用HindIII單酶切RCA擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得了1倍45 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第四章小麥矮縮病毒中國(guó)分離物侵染性克隆的構(gòu)建WDV長(zhǎng)度即2750bp的全基因組序列片段，此片段兩端均為HindIII酶切形成的黏性末端，見(jiàn)圖4.5（A）。從圖4.5（B）可以觀察到，用HindIII將重組質(zhì)粒pLH9000-0.42V線性化之后，得到的條帶大小為10284bp，與預(yù)期的載體長(zhǎng)度一致。由于線性化載體pLH9000-0.42V由單酶切獲得，極易發(fā)生載體自連現(xiàn)象，需要對(duì)其進(jìn)行末端去磷酸化處理，具體操作見(jiàn)4.1.1.5.2。(A)(B)圖4.5滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物及重組載體pLH9000-0.42V的線性化Fig.4.5DigestionofampliconofRCAandrecombinantplasmidpLH9000-0.42VbyHindIII(A)M：DL5000Marker；泳道1-2：HindIII將RCA擴(kuò)增產(chǎn)物線性化后電泳圖M:DL5000Marker;Lane1-2:AmpliconofRCAwasdigestedbyHindIII(B)M：DL15000Marker；泳道1-2：HindIII將重組質(zhì)粒pLH9000-0.42V線性化后電泳圖M:DL15000Marker;Lane1-2:DigestionofrecombinantplasmidpLH9000-0.42VbyHindIII4.2.1.3正確表達(dá)載體pLH9000-1.42V的篩選與酶切鑒定將線性化后的WDV全長(zhǎng)序列與末端去磷酸化后的載體pLH9000-0.42V進(jìn)行連接時(shí)，會(huì)出現(xiàn)正反兩種插入取向，只有通過(guò)后期篩選，才能獲得具有正確插入取向的重組表達(dá)載體。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，利用設(shè)計(jì)的插入取向檢測(cè)引物進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)。圖4.6顯示，挑取的30個(gè)單克隆中篩選到了7個(gè)正向插入的陽(yáng)性克隆，含有陽(yáng)性克隆的菌液搖培提取質(zhì)粒，便獲得了侵染性克隆表達(dá)載體pLH9000-1.42V。將獲得的表達(dá)載體分別利用HindIII單酶切鑒定以及利用HindIII與BamHI進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果表明，利用HindIII單酶切重組質(zhì)粒，重新分離出了2750bp的WDV基因組序列全長(zhǎng)的插入片段，利用HindIII與BamHI進(jìn)行雙酶切時(shí)，切出了三條帶，分別為9120bp的空載體、2750bp的WDV全長(zhǎng)序列片段以及1150bp較短的插入片段（0.42V），見(jiàn)圖4.7。酶切鑒定的結(jié)果顯示，已經(jīng)成功地將總長(zhǎng)1.42倍WDV正向串聯(lián)重復(fù)序列插入到了表達(dá)載體pLH9000的多克隆位點(diǎn)之中（圖4.8），可以利用該載體進(jìn)行后續(xù)的侵染性試驗(yàn)。46 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第四章小麥矮縮病毒中國(guó)分離物侵染性克隆的構(gòu)建圖4.6重組載體pLH9000-1.42V的菌液PCR鑒定Fig.4.6IdentificationofrecombinantplasmidpLH9000-1.42VbyPCRM：DL2000Marker；泳道1-30：重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后菌液PCR；31：陰性對(duì)照M:DL2000Marker;Lane1-30:PCRampliconsaftertransformationofrecombinantplasmid;31:Negativecontrol圖4.7重組質(zhì)粒pLH9000-1.42V的酶切鑒定Fig.4.7IdentificationofrecombinantplasmidpLH9000-1.42VbyrestrictionenzymedigestionM：DL15000Marker；泳道1：重組質(zhì)粒pLH9000-0.42V；泳道2：WDV全長(zhǎng)插入片段；泳道3：HindIII單酶切鑒定重組質(zhì)粒pLH9000-1.42V；泳道4：HindIIIandBamHI雙酶切鑒定重組質(zhì)粒pLH9000-1.42VM:DL15000Marker;Lane1:RecombinantplasmidpLH9000-0.42V;Lane2:GenomesequenceofWDV;Lane3:DigestionofpLH9000-1.42VbyHindIII;Lane4:DigestionofrecombinantplasmidpLH9000-1.42VbyHindIIIandBamHI47 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第四章小麥矮縮病毒中國(guó)分離物侵染性克隆的構(gòu)建圖4.8pLH9000-1.42V載體示意圖Fig.4.8SketchmapofpLH9000-1.42Vvector4.2.1.4凍融法轉(zhuǎn)化質(zhì)粒采用凍融法將侵染性克隆表達(dá)載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞中，利用菌落PCR法篩選陽(yáng)性克隆（圖4.9），空載體轉(zhuǎn)化作為陰性對(duì)照，搖培24h劃線培養(yǎng)2天，備用。采用固體菌落針刺法對(duì)初萌發(fā)的高感小麥矮縮病的揚(yáng)麥12號(hào)小麥種子進(jìn)行刺傷接種。圖4.9重組質(zhì)粒pLH9000-1.42V轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后的菌落PCRFig.4.9PCRampliconsaftertransformationofrecombinantplasmidpLH9000-1.42VM：DL5000Marker；泳道1-9：重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后菌落PCR；泳道10：陰性對(duì)照M:DL5000Marker;Lane1-9:TocheckrecombinantplasmidpLH9000-1.42VbyPCR;Lane10:Negativecontrol4.2.2農(nóng)桿菌針刺法侵染小麥及病毒檢測(cè)用含有WDV侵染性克隆的菌體接種感病小麥（揚(yáng)麥12號(hào)），實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示農(nóng)桿菌介導(dǎo)的病毒侵染性克隆接種20天后，部分小麥植株較之健康對(duì)照表現(xiàn)出了明顯的生長(zhǎng)遲緩、葉片黃化褪綠癥狀，持續(xù)觀察發(fā)現(xiàn)新抽出幼嫩的心葉有缺刻現(xiàn)象，這些癥狀表現(xiàn)初步證實(shí)寄主受到了病毒的侵染（圖4.10）。48 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第四章小麥矮縮病毒中國(guó)分離物侵染性克隆的構(gòu)建mockpLH9000-1.42V(A)(B)(C)圖4.10農(nóng)桿菌介導(dǎo)的pLH9000-1.42V接種小麥第20天后的癥狀表現(xiàn)（黃化、葉心缺刻、矮化）Fig.4.10Symptoms(chlorosis,incisionandstuntedgrowth)inducedbyagroinfectiousviralcloneonwheatat20dpi4.2.2.1生物學(xué)驗(yàn)證49 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第四章小麥矮縮病毒中國(guó)分離物侵染性克隆的構(gòu)建WDV侵染性克隆接種后的發(fā)病植株經(jīng)介體異沙葉蟬傳毒后，健康小麥植株上同樣出現(xiàn)了WDV的典型癥狀（圖4.11），柯赫氏法則的完成進(jìn)一步說(shuō)明適生寄主（小麥）侵染性克隆體系建立成功。圖4.11經(jīng)異沙葉蟬傳毒后的小麥癥狀表現(xiàn)Fig.4.11SymptomsinwheatsaftertransmittingvirusfrominfectedplantstohealthyonesbyPsammotettixstriatusL.4.2.2.2接種小麥的分子檢測(cè)利用檢測(cè)WDVCP基因的特異性引物（WDV-CP-F與WDV-CP-R）對(duì)生物學(xué)癥狀明顯的小麥做分子檢測(cè)，結(jié)果表明，具有典型癥狀的植株中均能擴(kuò)增出783bp的目的條帶（圖4.12）。第一批接種120株，成活105株，具有典型癥狀的有7株；第二批接種100株，成活81株，具有典型癥狀的9株。第三批接種160株，成活143株，具有典型癥狀的10株。綜合接種植株的癥狀表現(xiàn)、介體傳毒以及分子檢測(cè)結(jié)果，本研究所建立的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的WDV侵染性克隆的接種效率為6.7%-11.1%。圖4.12PCR檢測(cè)侵染性克隆接種后癥狀明顯的小麥Fig.4.12PCRdetectionofWDVinthesymptomaticwheatsM：DL2000DNAMarker；1-10：用引物WDV-CP-F和WDV-CP-R擴(kuò)增WDV特異片段；11：陰性對(duì)照；12：陽(yáng)性對(duì)照M:DL2000DNAMarker;1-10:PCRfragmentswiththeprimersWDV-CP-FandWDV-CP-R;11:Negativecontrol;12:Positivecontrol50 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第四章小麥矮縮病毒中國(guó)分離物侵染性克隆的構(gòu)建4.3總結(jié)與討論初期階段關(guān)于WDV的研究多集中于將其作為病毒載體表達(dá)外源基因或作為植物DNA病毒的模式生物進(jìn)行細(xì)胞調(diào)控等方面的基礎(chǔ)研究（Collin等，1996;Gooding等，1999;Hofer等，1992;Laufs等，1990;Matzeit等，1991;Timmermans等，1992）。然而，隨著該類病毒病害在世界范圍內(nèi)的日益猖獗，有關(guān)病毒致病分子機(jī)制方面的研究越來(lái)越受到人們的關(guān)注。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的侵染性克隆在研究植物病毒致病機(jī)制、交叉保護(hù)以及病毒誘導(dǎo)的基因沉默方面發(fā)揮了重要作用，尤其對(duì)于小麥矮縮病毒這類無(wú)法通過(guò)摩擦接種實(shí)現(xiàn)傳毒的植物病毒來(lái)講，更是不可或缺的研究工具。前人研究發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)的小麥矮縮病毒分離物，其基因組序列存在很大差異（Koklu等，2007;Kundu等，2009;Kvarnheden等，2002;Schubert等，2014;Tobias等，2011）。病毒在與寄主植物以及傳播介體的長(zhǎng)期相互作用中形成了不同的進(jìn)化機(jī)制，也導(dǎo)致了致病性方面的差異，這使得構(gòu)建不同地區(qū)分離物的侵染性克隆十分必要。本研究基于WDV陜西韓城分離物，利用植物雙元表達(dá)載體pLH9000構(gòu)建了一個(gè)含有病毒1.42倍全長(zhǎng)序列的侵染性克隆表達(dá)載體，命名為pLH9000-1.42V，通過(guò)固體菌落針刺法建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)的適生寄主（小麥）侵染體系，采用PCR方法以及介體傳毒法對(duì)接種后小麥植株病毒侵染情況進(jìn)行檢測(cè)。綜合分析多次接種及檢測(cè)的結(jié)果，本研究建立的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的WDV侵染性克隆的接種效率為6.7%-11.1%，影響侵染性克隆接種效率的因素主要有以下幾點(diǎn)：（1）與接種受體小麥的基因型有關(guān)。本研究中用于接種的小麥品種為高感小麥矮縮病的揚(yáng)麥12號(hào)，溫室內(nèi)經(jīng)異沙葉蟬傳毒，發(fā)病率100%，另外，該品種還高感葉銹病，中感條銹病和紋枯病。（2）與農(nóng)桿菌有關(guān)。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成功的前提是攜帶重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌首先需要侵染小麥，本研究選用的農(nóng)桿菌菌株EHA105為超毒菌株，侵襲力較強(qiáng)，有利于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的侵染性克隆體系的成功建立。（3）與接種時(shí)小麥胚部的生長(zhǎng)狀態(tài)及刺傷程度有關(guān)。由于本研究利用的是含有WDV侵染性克隆的固體菌落針刺法來(lái)進(jìn)行接種，接種部位是小麥的幼胚，因此胚部的生長(zhǎng)狀態(tài)對(duì)于接種效果來(lái)講至關(guān)重要，接種時(shí)期過(guò)早或過(guò)晚均不能達(dá)到理想的效果。另外，利用昆蟲(chóng)針透過(guò)固體菌落刺傷胚部的過(guò)程很容易造成小麥胚傷害過(guò)度，導(dǎo)致幼苗的死亡。在實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中，還發(fā)現(xiàn)有一部分接種后的小麥植株出現(xiàn)分蘗異常增多的現(xiàn)象，但未顯現(xiàn)出病毒病其他的癥狀，推測(cè)這可能只是由于胚部受到機(jī)械刺傷后的一種表現(xiàn)。本研究建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的WDV中國(guó)分離物侵染性克隆，通過(guò)PCR和介體傳毒法驗(yàn)證了侵染性克隆在適生寄主小麥的活性，接下來(lái)在如何提高侵染效率等方面還需要進(jìn)一步深入地研究。51 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第五章全文結(jié)論與展望第五章全文結(jié)論與展望5.1結(jié)論1.利用RNA-Seq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)WDV侵染下的小麥轉(zhuǎn)錄組表達(dá)情況進(jìn)行深度測(cè)序，通過(guò)數(shù)據(jù)拼接與聚類分析，共獲得了77221條基因注釋可信度較高的unigene。比較感染病毒組與健康對(duì)照組，共獲得了4324個(gè)顯著表達(dá)差異的基因，其中上調(diào)表達(dá)的基因有2136個(gè)，下調(diào)表達(dá)的基因有2188個(gè)，這些基因在植物體內(nèi)主要參與老化、植物激素代謝、光合作用、抗氧化等多個(gè)生物學(xué)過(guò)程。2.為了揭示W(wǎng)DV誘導(dǎo)寄主癥狀形成的原因，從轉(zhuǎn)錄組分析數(shù)據(jù)中篩選出10個(gè)植物激素代謝相關(guān)、7個(gè)光合作用相關(guān)及6個(gè)植物防衛(wèi)反應(yīng)途徑相關(guān)的差異表達(dá)基因進(jìn)行qPCR驗(yàn)證。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果推論，WDV侵染造成小麥植株嚴(yán)重矮化的原因可能是病毒打亂了植物體內(nèi)各種激素之間的動(dòng)態(tài)平衡關(guān)系，具體表現(xiàn)為促進(jìn)赤霉素、生長(zhǎng)素、油菜素甾醇等合成或積累的相關(guān)基因下調(diào)表達(dá)，而抑制這類激素運(yùn)輸?shù)哪承┗蛏险{(diào)表達(dá)。感病小麥分蘗的異?？赡芘c細(xì)胞分裂素、脫落酸代謝的變化有關(guān)。WDV的侵染導(dǎo)致光合作用關(guān)鍵酶RuBisCO活性下降，而葉綠素合成與分解代謝中的某些基因的差異表達(dá)變化表明感病小麥體內(nèi)葉綠素代謝的紊亂，這些都可能導(dǎo)致葉片褪綠黃化癥狀的發(fā)生。另外，本研究證實(shí)植物啟動(dòng)了水楊酸途徑、基因沉默途徑等來(lái)抵御病毒的侵染，然而在感染病毒的寄主體內(nèi)一些參與植物防衛(wèi)反應(yīng)的相關(guān)基因如POD、SOD、PPO表達(dá)水平下降，這種現(xiàn)象在一定程度上意味著植物的某些防御體系可能已經(jīng)被病毒攻破。3.利用RNA-Seq高通量測(cè)序技術(shù)，分析了WDV侵染誘導(dǎo)小麥體內(nèi)miRNA的表達(dá)差異，結(jié)果顯示這些受到miRNA調(diào)控的靶標(biāo)基因主要是生長(zhǎng)素響應(yīng)因子、微管蛋白折疊輔因子、水解酶、抗病相關(guān)蛋白等。將miRNA與mRNA差異分析結(jié)果進(jìn)行負(fù)相關(guān)聯(lián)合分析，結(jié)果獲得了一些重要的調(diào)控信息：受tae-miR5384-3p調(diào)控的FACTcomplexsubunitSPT16在轉(zhuǎn)錄、復(fù)制以及DNA修復(fù)方面發(fā)揮重要作用，受其調(diào)節(jié)的CYP450在植物體內(nèi)參與植物激素、萜類、黃酮類等化合物的生物合成以及外源化合物的代謝解毒；受tae-miR2275-3p調(diào)控的Pentatricopeptiderepeat（PPR）與植物葉片內(nèi)葉綠素含量以及葉綠體發(fā)育過(guò)程相關(guān)，此外該miRNA還參與調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)座子基因的表達(dá)；受tae-miR1123調(diào)控的Rubberelongationfactor（REF）參與植物防衛(wèi)反應(yīng)；tae-miR160的靶標(biāo)基因?yàn)楦哂H和性鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Highaffinitypotassiumtransporter）；tae-miR9774的靶標(biāo)基因?yàn)楹蠳B-ARC結(jié)構(gòu)域的抗病相關(guān)蛋白（NB-ARCdomain-containingdiseaseresistanceprotein），該蛋白參與細(xì)胞凋亡以及植物的一系列防衛(wèi)反應(yīng)。WDV誘導(dǎo)寄主小麥miRNA差異表達(dá)分析，解析了植物受到病毒侵染以后代謝路徑的變化過(guò)程，也為研究病毒致病機(jī)理提供依據(jù)。4.本研究利用植物雙元表達(dá)載體pLH9000構(gòu)建了一個(gè)含有病毒1.42倍全長(zhǎng)序列的侵染性克隆表達(dá)載體pLH9000-1.42V，以針刺法接種小麥，分別利用PCR檢測(cè)法和介體傳毒法對(duì)接種小麥進(jìn)行檢測(cè)和驗(yàn)證，建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的WDV適生寄主（小麥）侵染體系。結(jié)果表明，所建立的WDV侵染性克隆可以在寄主上發(fā)生系統(tǒng)侵染，這也為探究植物病毒致病分子機(jī)制、構(gòu)建病毒過(guò)量表達(dá)載體和病毒誘導(dǎo)的基因沉默載體提供了重要的研究工具。52 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第五章全文結(jié)論與展望5.2展望（對(duì)后續(xù)研究工作的展望）1.在癥狀形成相關(guān)的基因中，吲哚-3-甘油磷酸合酶（Indole-3-glycerolphosphatesynthase）以及內(nèi)根-貝殼杉烯合成酶（Ent-kaurenesynthase-like3）分別是生長(zhǎng)素以及赤霉素合成過(guò)程的關(guān)鍵酶，WRKY蛋白家族是植物特有的一類抗性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，在siRNA介導(dǎo)的基因沉默中發(fā)揮重要作用的AGO4基因等，有必要對(duì)這些基因進(jìn)行功能驗(yàn)證。主要的技術(shù)手段有：利用蛋白組學(xué)的方法篩選WDV侵染下小麥在蛋白水平的表達(dá)差異，采用VIGS、酵母雙雜交等技術(shù)驗(yàn)證基因功能或闡明病毒與寄主之間的互作機(jī)制。2.在植物與病毒互作中，表型的發(fā)生并不是孤立的，眾多的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與其中。本研究中通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析獲得的差異表達(dá)基因中，涉及到許多其他的代謝通路，例如，植物抗病響應(yīng)蛋白家族中的病程相關(guān)蛋白、衰老相關(guān)蛋白DIN1等參與的老化與抗衰老進(jìn)程、磷饑餓響應(yīng)與磷酸根離子轉(zhuǎn)運(yùn)、雌雄配子體發(fā)育過(guò)程、細(xì)胞壁降解、DNA修復(fù)、泛素-蛋白酶降解途徑、呼吸作用中電子傳遞、多種糖類的代謝及一些微量元素或金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)等等，這些代謝途徑的差異變化，表明病毒的侵染對(duì)于寄主的正常生理生化過(guò)程產(chǎn)生了極為廣泛的影響，對(duì)于這些基因的進(jìn)一步研究，可以從更多的層面揭示病毒的致病機(jī)理。3.在進(jìn)一步提高農(nóng)桿菌介導(dǎo)的侵染性克隆侵染效率的基礎(chǔ)上，利用侵染性克隆對(duì)病毒致病相關(guān)基因的關(guān)鍵功能域及關(guān)鍵氨基酸進(jìn)行分析，可以從更深的層次揭示病毒致病的分子機(jī)理。53 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中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文附錄附錄qPCR方法驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)引物列表引物名稱引物序列備注RemarkPrimernamePrimersequence(5′-3′)內(nèi)參基因ElongationFactor1-AlphaEF1α-FGTCAGATTGGCAACGGCTACG（EF-1α）EF1α-RCTCCAGCTCCTTACCAGATCGCGTP-FCTTTGAGAGCCAGAGACTGTGCG內(nèi)參基因GTPbindingprotein（GTPB）GTP-RAACAGTTTGCAGCCCACCAGACPP2A-FCGCATCGTGACCAAAGTGTATACCT內(nèi)參基因Proteinphosphatase2A（PP2A）PP2A-RCGTTCACTACCACAGCATCCACCTUB-FCAACTCCGATCTTCGCAAGCTTG內(nèi)參基因Betatubulin[TUBβ(Tubb4)]TUB-RGGACTGTGAGAGCACGGTACATTTGPIN-FCTGATGTATCCAAGGCTCTGCGEffluxcarrierofpolarauxintransportPIN-RGATGCTTGTCTCCCTGCCATTGHydroxycinnamoyl-CoAshikimate/quinateCoA-FAAGCCTGGACGTGTTCGTCATChydroxycinnamoyltransferaseCoA-RCTGCCCATCGAAGGAATAATGATCAUX10-FAATACCCATGGATTGTGGTGAGCAuxinresponsefactor10AUX10-RGGAGCATGAAGTCTACCTGCCTGIAA-FAGCTCGAGCAACCACAACGAGIAA8IAA-RCTGCAACCGGAGGAGTCCTGCYT-FAGGCTGGTGTCGATGACAAGGCytokinin-N-glucosyltransferase1CYT-RATCCTCGCGATGAACGATGCPP10-FACTCGTACGCGCTGCAGTACCPurinepermease10PP10-RCGTTGATGAGGCGGGAGGTEnt-FGAGACATGTGCCATGGCGTTCEnt-kaurenesynthase-like3Ent-RCGTGTCACTCAGATCGGTGGAGFBW-FAAGCTCCGACACCTCGAGATATGTA2protein/F-BOXWITHWD-402FBW-RCACGCCAATCTAAGCACTTGAGGIGPS-FGTCGAGATCAGTTAGCACAGCAGCIndole-3-glycerolphosphatesynthase-likeIGPS-RCTGTGCAAAGAGTTCGTCGTTGATBLR-FGGTTCTTGACATGCGGTCCATGBrassinosteroidLRRreceptorkinaseBLR-RGGTGATTATCCGTATCAGGTTGCG61 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文附錄qPCR方法驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)引物列表（續(xù)）引物名稱引物序列備注RemarkPrimernamePrimersequence(5′-3′)Ribulose1,5-bisphosphatecarboxylasesmallRub-FCCGTCAGTACAACAGTTCACCAGGsubunitmRNARub-RTCAACACCTGAGCAGCATCAGTGBTV-FTGATGATCAATGACCTAGATGCTGGRuBisCOactivaseBTV-RGCCAAGTTCATCAATGTTCCAACCLHC-FGCCAAGAAAGGAGAGTGGTTGCLHCItypeIVchlorophyllbindingproteinLHC-RCGAGTCCCAATGGATCGAATCNADP-FCTTCGCTTGATAGTGTCCGCCProtochlorophyllidereductaseBNADP-RGCAGTTGGCTGGTAAACAGCAGRCR-FCTGATGCCAGATGGCTGGACACRedchlorophyllcatabolitereductaseRCR-RCAGTGCATGTTCTCCAACAGCGCAD-FACAAGCACTGTGTCCAATGACCACCarbonicanhydrase,chloroplastprecursorCAD-RTGGTTCCACCATATGACCAGGCPPT-FAGCTGCCATTACCATTGCCAGTriosephosphate/phosphatetranslocatorPPT-RATCCTCACACGGTTCTGGCTTGSOD-FACGACGGTGAACGTTCGTATCACSuperoxidedismutaseSOD-RGTGGACCTGTTGATATGCATCCATPOD-FTTCGACGGCGTCTACTTCAAGGPeroxidase47precursorPOD-RACATGTTCACCAGCCGCTGCPPO-FGGATCCGCTCGTGGAAGTAGAGGPolyphenoloxidasePPO-RCCTACGACCAGGTCGGCTTCCAGO4-FGTGCTCATGCGGGACCTATAGGArgonaute4proteinAGO4-RACTAGGCTCTGGAGTTCATCTGCTGWRKY-FCGAAGTGGTCCCAGTCCAAGCWRKYtranscriptionfactor48WRKY-RGTCGGAGGACTCACACGCGATAK2-FGGCTTCGAGTGTATGTTCCACCTGWall-associatedkinase2AK2-RCTGGTCCAAATACTAGATCCGCAGG62 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文附錄侵染性克隆構(gòu)建引物列表引物名稱Primername引物序列Primersequence(5′-3′)備注Remark0.4V-HindIII-FCACGAAGCTTGTTCTGCACGAGAACGHindIII酶切位點(diǎn)BamHI、KpnI酶切位點(diǎn)0.4V-BamHI-RCGCGGATCCGGTACCCTGTATGTTAAATTTGOrient-FCTAGGACAGTCACTGCGAAGCAG插入取向檢測(cè)Orient-RGTGATCAGGATCCGGTACCCTGTATG插入取向檢測(cè)WDV-CP-FATGGTGACCAACAAGGACTCCWDV檢測(cè)（下同）WDV-CP-RTTACTGAATGCCGATGGCTTTGWDV-245FCGACTACGCCTGGCGAACATTTGWDV-1418RCATCAACTACTCGTTCGCCTCCGGWDV-1381FCAGTGACATCTTCGCCGGAGWDV-2445RTGTACCCTTGAGCCACAGTACGCCWDV-2420FAAGGCGTACTGTGGCTCAAGGGWDV-435RGGAGTCCTTGTTGGTCACC63 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文致謝致謝歲月匆匆，師恩難忘。點(diǎn)滴暖心，如沐春風(fēng)。首先，在此對(duì)我的恩師劉艷副研究員致以崇高的敬意和真誠(chéng)的感謝！劉老師在我課題完成的每一個(gè)階段都給予了細(xì)致入微的指導(dǎo)和幫助，令我深受感動(dòng)。您是一位貼心的導(dǎo)師，無(wú)論在生活上還是在實(shí)驗(yàn)上面臨困難時(shí)，總能得到您耐心的教導(dǎo)和溫暖的關(guān)懷。感謝您能包容我有時(shí)候小小的固執(zhí)和倔強(qiáng)，感謝你讓我學(xué)會(huì)了怎樣去學(xué)習(xí)和生活，感謝在我的人生中能遇到這樣一位好老師，好朋友。特別感謝王錫鋒研究員，王老師治學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)、正直敬業(yè)的可貴精神，是我們學(xué)習(xí)的榜樣。您對(duì)我們的嚴(yán)格要求是因?yàn)榻o予了厚望，感謝您在實(shí)驗(yàn)上給予的諸多指導(dǎo)和教誨，感謝您為整個(gè)課題組的日夜操勞和辛勤付出。感謝和藹可親的周廣和先生、溫文爾雅的李莉老師和親民友善的吳蓓蕾老師對(duì)我學(xué)習(xí)和生活上的關(guān)心，感謝你們?yōu)檎n題組做出的貢獻(xiàn)。感謝已經(jīng)畢業(yè)的王亞嬌師姐、雷陽(yáng)師兄、張鵬師兄、武科科師姐、ThiThiMar、金文師姐、李羽師姐，你們的優(yōu)秀讓我看到了努力的希望，真誠(chéng)地祝福你們都能有美好的前程。感謝依然可以在一起奮斗、一起歡笑的糧食作物病毒病害組的兄弟姐妹：劉文文、王彪、秦發(fā)亮、Jamal、WinThan、張培培、趙藝澤、尚曉楠、劉貝貝、張宏波、簡(jiǎn)熠、王惠、馮耿、吳慧娟、辛敏等，特別感謝為實(shí)驗(yàn)室良好運(yùn)轉(zhuǎn)付出辛勤勞動(dòng)的苗苗姐和武麗姐，感謝兩位好姐姐在實(shí)驗(yàn)上和生活提供的關(guān)心和幫助，苗苗姐在葉蟬飼養(yǎng)傳毒和材料種植管理方面給予了太多的支持。和諧友善、快樂(lè)天天的實(shí)驗(yàn)室大家庭是大家共同努力構(gòu)筑的，團(tuán)結(jié)奮進(jìn)、不離不棄的實(shí)驗(yàn)室好氛圍是大家齊心協(xié)力營(yíng)造的，感謝有你們陪伴我度過(guò)三年充實(shí)而快樂(lè)的美好時(shí)光，無(wú)論何時(shí)，無(wú)論何地，都是一輩子的朋友！誠(chéng)摯地感謝西北農(nóng)林科技大學(xué)郝興安老師在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中諸多細(xì)節(jié)上的指導(dǎo)以及后期實(shí)驗(yàn)材料方面提供的幫助。感謝上海烈冰信息科技有限公司侯朋偉先生在高通量測(cè)序數(shù)據(jù)分析上給予的幫助。感謝曾在這里實(shí)習(xí)的李文燕、毛文渝、母熙等，雖然只有短暫的相處，但讓我看到了你們身上樂(lè)觀向上、熱情洋溢的年輕活力，希望實(shí)驗(yàn)室的點(diǎn)點(diǎn)滴滴能給大家?guī)?lái)永恒的美好回憶。碩士八班，一個(gè)神奇的班級(jí)！感謝碩士八班班主任高弘毅老師以及所有可愛(ài)的同學(xué)們，永遠(yuǎn)不會(huì)忘記大家一起歡笑、一起奮斗的美好歲月，感謝大家能匯聚在一個(gè)這么有愛(ài)的班集體之中。永遠(yuǎn)記得大家一起拔河、一起聚餐、一起合唱、一起游玩、一起學(xué)習(xí)的美好瞬間，一句話，一輩子，一生情，一杯酒！感謝我的父母家人以及親朋好友的支持和鼓勵(lì)，你們無(wú)私的關(guān)愛(ài)是我在挫折面前重燃生機(jī)的最大動(dòng)力，你們幸福的微笑是我在人生路上奮力向前的璀璨燈塔。衷心地祝愿：福壽安康、幸福久長(zhǎng)！64 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文作者簡(jiǎn)歷作者簡(jiǎn)歷姓名：王亮性別：男籍貫：山東榮成學(xué)歷：農(nóng)學(xué)碩士教育背景：2012.9-2015.7中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病理學(xué)碩士2008.9-2012.7山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院種子科學(xué)與工程學(xué)士碩士期間發(fā)表論文：1.LNA探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)小麥矮縮病毒體系的建立（《植物病理學(xué)報(bào)》2015年4月已接收）2.LiuY,JinW,WangL,andWangXF.Replication-associatedproteinsencodedbyWheatdwarfvirusactasRNAsilencingsuppressors.VirusResearch[J],2014,190:34-39.65
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