蜜環(huán)菌多糖口服降血糖作用及其機(jī)制研究

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1、III摘要當(dāng)前，糖尿病是一個(gè)全球性的健康問題，具有較高的發(fā)病率和死亡率，由于臨床治療藥物常伴有明顯的副作用，尋找天然產(chǎn)物作為安全無毒的降血糖保健食品成為了研究熱點(diǎn)。蜜環(huán)菌是藥、食兼用真菌，多糖是其主要活性成分。研究表明，蜜環(huán)菌多糖具有抗氧化、提高免疫和降血糖等生物活性，但降血糖作用機(jī)制尚未闡明。因此，本論文擬研究蜜環(huán)菌多糖的口服降血糖作用及其機(jī)制。將蜜環(huán)菌子實(shí)體經(jīng)過熱水煮提、醇沉、木瓜蛋白酶和纖維素酶聯(lián)合酶解得到蜜環(huán)菌總糖AMP。再利用DEAE-纖維素離子交換層析對(duì)AMP進(jìn)行分離純化，得到水洗脫的

2、中性糖AMP-N和0.4MNaCl洗脫的酸性糖AMP-A。運(yùn)用高效液相色譜法分析單糖組成，結(jié)果表明AMP和AMP-N中葡萄糖與半乳糖的含量比為1:1,推測(cè)含有半乳葡聚糖結(jié)構(gòu)域，AMP-A中葡萄糖與半乳糖的含量比為10:1，推測(cè)含有葡聚糖結(jié)構(gòu)域。體外實(shí)驗(yàn)中，首先利用建立的高糖高脂誘導(dǎo)胰島素抵抗細(xì)胞模型，比較了三種蜜環(huán)菌多糖對(duì)胰島素抵抗的改善活性。AMP和AMP-N顯示出較好的改善活性，通過激活I(lǐng)R-Akt-AMPK信號(hào)通路改善胰島素抵抗，而AMP-A沒有改善作用，說明半乳葡聚糖可能是其主要的活性結(jié)構(gòu)

3、域。然后利用GFP-LC3穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞和人肝癌細(xì)胞，分析自噬小體和自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)，比較了三種蜜環(huán)菌多糖誘導(dǎo)自噬的能力。AMP和AMP-N促進(jìn)了自噬小體的形成。同時(shí)，增加了p62蛋白的降解，促使LC3-I向LC3-II的轉(zhuǎn)化，說明AMP和AMP-N具有顯著誘導(dǎo)自噬的能力。相反，AMP-A誘導(dǎo)自噬能力較弱。結(jié)合胰島素抵抗改善的結(jié)果，推測(cè)AMP和AMP-N改善胰島素抵抗可能與其誘導(dǎo)自噬相關(guān)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，運(yùn)用db/db糖尿病小鼠，優(yōu)化了蜜環(huán)菌多糖口服降血糖的劑量和給藥時(shí)間，確定最佳給藥劑量為50mg/kg

4、/d，給藥時(shí)間為4周。通過隨機(jī)血糖、GTT和ITT實(shí)驗(yàn)，表明AMP和AMP-N具有顯著的口服降血糖作用，且AMP-N的降血糖程度強(qiáng)于AMP，而AMP-A沒有降血糖效果，這與體外改善胰島素抵抗的結(jié)果一致。血清生化因子分析，AMP和AMP-N降低了血清甘油三酯和游離脂肪酸，說明調(diào)節(jié)了糖尿病小鼠的脂質(zhì)代謝；降低了谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶，說明保護(hù)了糖尿病小鼠的肝臟功能；降低了血清中胰島素含量，說明改善了胰島素抵抗。肝臟HE染色分析，AMP-N減少了肝臟脂滴的數(shù)量，干預(yù)了脂滴的形成，說明抑制了小鼠肝臟脂肪堆

5、積。肝臟自噬相關(guān)蛋白表達(dá)分析，AMP-N顯著增加了p62蛋白的降解，加大了LC3-I向LC3-II的轉(zhuǎn)化，說明提高了小鼠肝臟的自噬水平。同時(shí)，胰島形態(tài)分析結(jié)果顯示AMP-N保護(hù)了糖尿病小鼠胰島結(jié)構(gòu)的完整性和致密性，恢復(fù)了胰島受損的功能。此外，還分析了蜜環(huán)菌多糖的毒性。在給藥期間，蜜環(huán)菌多糖對(duì)小鼠的體重、隨機(jī)血糖、肝重和脂肪重量均無影響，說明蜜環(huán)菌多糖安全無毒。I綜上所述，蜜環(huán)菌總糖AMP和中性糖AMP-N具有顯著的口服降血糖活性，且AMP-N的降血糖作用優(yōu)于AMP。結(jié)合單糖組成結(jié)果，推測(cè)半乳葡聚糖

6、可能是其主要的活性結(jié)構(gòu)域。AMP-N降血糖作用的機(jī)制，一方面提高糖尿病小鼠肝臟的自噬水平，減少脂肪堆積，提高胰島素敏感性；另一方面，保護(hù)糖尿病小鼠的胰島，改善受損的功能。論文的結(jié)果將為蜜環(huán)菌的開發(fā)和利用奠定基礎(chǔ)，為降血糖保健食品的研發(fā)提供依據(jù)。關(guān)鍵詞：蜜環(huán)菌；多糖；降血糖；胰島素抵抗；自噬IIAbstractCurrently,diabetesisaglobalhealthproblemwithhighmorbidityandmortality.Sinceclinicaltherapeuticdr

7、ugsareoftenaccompaniedbyobvioussideeffects,lookingfornaturalproductsasasafeandnon-toxichypoglycemichealthfoodhasbecomearesearchhotspot.Amillariellamelleaisanediblefungus,andpolysaccharidesarethemainactiveingredients.Studieshaveshownthatpolysaccharides

8、fromAmillariellamelleahavebiologicalactivitiessuchasantioxidation,immuneenhancement,andhypoglycemicactivity,butthemechanismofhypoglycemicactionhasnotyetbeenelucidated.Therefore,thispaperintendstostudytheoralhypoglycemiceffectandmechanismofpoly