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1、密級(jí)：論文編號(hào)：中囯農(nóng)業(yè)科學(xué)院學(xué)位論文豬帶絳蟲(chóng)組織蛋白酶B基因的克隆、表達(dá)及功能研究Cloning,ExpressionandCharacterizationofCathepsinBfromTaeniasolium碩士研宄生.?孫銘苑指導(dǎo)教師：才學(xué)鵬研宄員申請(qǐng)學(xué)位類(lèi)別：農(nóng)學(xué)碩士專(zhuān)業(yè)：?獸醫(yī)學(xué)研宄方向：魂培養(yǎng)單位：蘭州獸醫(yī)研究所研究生院2015年5月Secrecy:No.ChineseAcademyofAgriculturalSciencesDissertationCloning,ExpressionandCharacte
2、rizationofCathepsinBfromTaeniasoliumMS.Candidate：SunMingyuanSupervisor：ProfessorCaiXuepengMajor：PreventiveVeterinaryMedicineSpecialty:AnimalVaccinesandMolecularImmunologyMay2015摘要豬囊尾蚴能夠引起豬和人的囊蟲(chóng)病，影響?zhàn)B豬業(yè)的發(fā)展和人類(lèi)的健康。組織蛋白酶B是半胱氨酸蛋白酶家族成員，在寄生蟲(chóng)的營(yíng)養(yǎng)、生長(zhǎng)發(fā)育、組織遷移、蛋白加工和活化以及免疫逃避等方面
3、發(fā)揮重要作用，是預(yù)防及治療多種寄生蟲(chóng)疾病的潛在的藥物靶標(biāo)和疫苗候選分子。本文對(duì)豬帶絳蟲(chóng)組織蛋白酶B基因進(jìn)行了克隆、表達(dá)及功能的初步研究。取得了以下結(jié)果：1.以豬帶絳蟲(chóng)的cDNA為模板，成功地?cái)U(kuò)增了豬帶絳蟲(chóng)組織蛋白酶B基因（TscpB）。利用生物信息學(xué)工具，對(duì)該序列進(jìn)行分析。結(jié)果表明該基因ORF大小為1074bp，編碼357個(gè)氨基酸，理論分子質(zhì)量為39.27ku，具有組織蛋白酶B的特征結(jié)構(gòu)域。Real-timePCR結(jié)果表明，組織蛋白酶B基因在成蟲(chóng)期表達(dá)量顯著高于囊尾蚴時(shí)期。2.構(gòu)建了原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET30a-Tscp
4、B，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)，獲得了以包涵體形式存在的重組蛋白rTscpB，分子大小約為38ku。Westernblotting分析表明，rTscpB能被豬囊尾蚴病陽(yáng)性血清特異性識(shí)別。用純化后的rTscpB免疫家兔，4次免疫后產(chǎn)生了特異性的高滴度IgG抗體。免疫組化結(jié)果表明，rTscpB主要表達(dá)于成蟲(chóng)的體壁及生殖器官，證明豬帶絳蟲(chóng)組織蛋白酶B可能與蟲(chóng)體攝取營(yíng)養(yǎng)以及生殖發(fā)育有關(guān)。3.構(gòu)建了畢赤酵母真核表達(dá)重組質(zhì)粒pPIC9K-TscpB。明膠酶譜實(shí)驗(yàn)證明yTscpB具有水解活性，且能夠降解熒光底物Z-Phe-Arg-AMC，最適pH為5
5、.5。yTscpB還能降解豬IgG、BSA、纖連蛋白等大分子。yTscpB的水解活性能被E-64特異性抑制。底物實(shí)驗(yàn)表明豬帶絳蟲(chóng)組織蛋白酶B可能在攝取營(yíng)養(yǎng)、入侵宿主等方面發(fā)揮作用。4.利用同源模建的方法預(yù)測(cè)了豬帶絳蟲(chóng)組織蛋白酶B蛋白的結(jié)構(gòu)，利用分子對(duì)接的方法預(yù)測(cè)了組織蛋白酶B蛋白與抑制劑E-64之間相互作用的模式。關(guān)鍵詞：豬帶絳蟲(chóng)，組織蛋白酶B，免疫定位，酶活力，同源模建IIIAbstractTaeniasoliummetacestodes,thatcancausecysticercosisinpigsandhumans
6、,seriouslyaffecttheproductionofpigsandthehealthofhumanbeings.CathepsinBisoneoftheimprotantmembersofcysteineproteases.ItwasprovedbymanypreviousstudiesthatcathepsinBhadavarietyoffunctionsinparasitepathogenicityandfacilitatedparasiteevasionfromhostimmuneresponses,es
7、sentialnutrientuptakeandtissuepenetration,whichcontributestheenzymeapromisingtargetforchemotherapyorimmunoprophylaxis.Therefore,thisresearchwasfocusedonthecloning,expressionandcharacterizationofcathepsinBgenefromT.solium.Wehaveachievedthefollowingresults:1.Making
8、useofthecDNAofT.soliumasatemplate,wefirstamplifiedcathepsinBgene.Wealsousedbioinformatictoolstoanalyzethegenesequence.ThesequenceanalysisshowedthatitsORFwas107
