水稻耐低氮基因克隆與功能分析

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1、分類號(hào)：單位代碼：密級(jí)學(xué)號(hào)：、令博士學(xué)位論文水稻耐低氮基因克隆與功能分析研究生張陽軍■指導(dǎo)教師孫傳清教授申請學(xué)位門類級(jí)別農(nóng)學(xué)博士專業(yè)名稱作物遺傳育種研宄方向水稻分子遺傳所在學(xué)院農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院二零一五年五月獨(dú)創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的學(xué)位論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研宄工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中已經(jīng)注明引用和致謝的內(nèi)容外，論文中不包含本人和其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研宄成果，也不包含為獲得中國農(nóng)業(yè)大學(xué)或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研宄所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意。學(xué)位論文作者簽名：時(shí)間：爽年月么日關(guān)于學(xué)位論文使

2、用授權(quán)的說明本人完全了解中國農(nóng)業(yè)大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定。本人同意中國農(nóng)業(yè)大學(xué)有權(quán)保存及向國家有關(guān)部門和機(jī)構(gòu)送交論文的紙質(zhì)版和電子版，允許論文被查閱和借閱；本人同意中國農(nóng)業(yè)大學(xué)將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容授權(quán)匯編錄入《中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫》或《中國優(yōu)秀碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫》進(jìn)行出版，并享受相關(guān)權(quán)益。保密的學(xué)位論文在解密后應(yīng)遵守此協(xié)議）學(xué)位論文作者簽名：衫時(shí)間：《年月丨曰導(dǎo)師簽名：時(shí)間：年：月》日中國農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文摘要摘要氮是作物生長和發(fā)育所必需的大量營養(yǎng)元素，也是農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)最為關(guān)鍵的營養(yǎng)元素。氮營養(yǎng)供應(yīng)不充足則會(huì)導(dǎo)致作物減產(chǎn)，而過量施用氮肥會(huì)造成農(nóng)業(yè)和生態(tài)環(huán)

3、境的破壞。因此，挖掘水稻耐低氮基因、培育氮高效的水稻品種對(duì)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有十分重要的意義。本研宄以秈稻特青為背景的云南元江普通野生稻滲入系為材料，通過對(duì)滲入系水培苗期和大田全生育期的耐低氮性狀鑒定，結(jié)合滲入系的基因型，進(jìn)行苗期和全生育期耐低氮分析。并利用一個(gè)苗期對(duì)低氮敏感滲入系，與特青雜交構(gòu)建的次級(jí)定位群體，精細(xì)定位并克隆了水稻耐低氮基因并對(duì)其功能進(jìn)行了分析。主要結(jié)果如下：以云南元江普通野生稻滲入系為材料，共定位到個(gè)影響苗期耐低氮相關(guān)性狀的它們所解釋的表型變異范圍為。。通過對(duì)滲入系田間全生育期耐低氮性狀的鑒定，定位了個(gè)耐低氮，的元江普通野生稻等位基因能提髙群體耐低氮能力。利用苗

4、期對(duì)低氮敏感滲入系與受體親本特青回交，構(gòu)建次級(jí)分離群體，將水稻耐低氮基因定位在水稻第染色體長臂末端標(biāo)記區(qū)間，然后利用重點(diǎn)交換單株進(jìn)一步將限定在一個(gè)約的區(qū)間內(nèi)。通過對(duì)定位區(qū)間的候選基因表達(dá)分析、測序和遺傳轉(zhuǎn)化，克隆了，發(fā)現(xiàn)該基因編碼一個(gè)具有指紋基序的甜味蛋白，該基因能顯著降低低氮條件下水稻苗期的值、株高、根長、植株干重、氮濃度和植株總氮量以及大田成熟期的有效穗數(shù)、每穗實(shí)粒數(shù)以及單株產(chǎn)量，過表達(dá)能提高水稻苗期耐低氮能力以及大田成熟期的產(chǎn)量。不同組織器官表達(dá)分析以及檢測結(jié)果表明該基因主要在水稻幼芽、新葉和幼穗中表達(dá)，在水稻新根和莖中也有少量表達(dá)；共表達(dá)載體轟擊洋蔥表皮的亞細(xì)胞定位結(jié)果表明

5、該基因作用于細(xì)胞膜。通過對(duì)來自個(gè)國家和地區(qū)份軸稻品種和份粳稻品種的序列分析表明，只有份秈稻品種含有基因，而份秈稻品種和所有檢測的粳稻品種均不含有耐低氮的基因。由此可見，基因在水稻育種中具有廣泛的應(yīng)用前景。進(jìn)一步關(guān)聯(lián)分析表明，啟動(dòng)子區(qū)域個(gè)和編碼區(qū)個(gè)使攜帶基因品種的耐低氮特性增強(qiáng)。關(guān)鍵詞：普通野生稻，滲入系，耐低氮，基因克隆，功能分析中國農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文，，技，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文目錄目錄第一章文獻(xiàn)綜述氮素是植物生長和發(fā)育最重要的營養(yǎng)元素植物的氮源氮的營養(yǎng)功能氮的生理功能植物氮的吸收植物氮的同化植物氮的轉(zhuǎn)運(yùn)與利用植物響應(yīng)氮脅迫的生理機(jī)制和分子機(jī)理植物氮

6、利用效率相關(guān)的定位氮代謝相關(guān)基因的克隆立論依據(jù)和研宄意義第二章材料與方法遺傳群體元江野生稻滲入系敏感滲入系和特青的次級(jí)定位群體表型鑒定苗期耐低氮鑒定大田全生育期耐低氮鑒定提取基因型分析數(shù)據(jù)分析電鏡觀察掃描電鏡觀察樣品制備透射電鏡超薄切片制備酵母雙雜交載體連接酵母感受態(tài)的制備轉(zhuǎn)化酵母菌自激活檢測互作驗(yàn)證中國農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文目錄基因組功能互補(bǔ)載體構(gòu)建組成型載體構(gòu)建載體構(gòu)建共表達(dá)載體構(gòu)建載體構(gòu)建水稻遺傳轉(zhuǎn)化檢測檢測提取及表達(dá)分析總提取和純化反轉(zhuǎn)錄基因表達(dá)分析芯片雜交取樣時(shí)間和部位總的提取與純化的合成與純化的體外轉(zhuǎn)譯真核生物樣品基因芯片（的雜交、洗脫、染色及掃描數(shù)據(jù)分析序列測定與分析引

7、物序列第三章結(jié)果與分析元江普通野生稻滲入系群體耐低氮定位苗期耐低氮定位滲入系大田全生育期耐低氮定位滲入系耐低氮特性鑒定和基因型分析滲入系水培表型及基因型分析滲入系和受體親本特青在大田條件下低氮處理的表型滲入系對(duì)其它非生物脅迫的響應(yīng)。熱脅迫。冷脅迫模擬干旱脅迫的鹽脅迫芯片雜交數(shù)據(jù)的分析水稻耐低氮基因的精細(xì)定位與候選基因的遺傳互補(bǔ)中國農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文目錄基因的結(jié)構(gòu)分析基因的表達(dá)分析亞細(xì)胞定位基因序列及其功能位點(diǎn)分析對(duì)不含水稻品種耐低氮特性的影響基因參與的代謝途徑基因的