資源描述：
《甜高粱ssadh基因克隆鑒定及耐鹽高粱品種的篩選》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在學術論文-天天文庫。
1、西南科技大學研究生學位論文甜高粱SSADH基因克隆鑒定及耐鹽高粱品種的篩選年級2012級姓名王龍海申請學位級別理學碩士專業(yè)生物化學與分子生物學指導老師朱莉副研究員ClassifiedIndex:U.D.C:SouthwestUniversityofScienceandTechnologyMasterDegreeThesisSweetSorghumSSADHGeneCloneIdentifyandSaltToleranceSorghumSpeciesScreeningGrade:2012Candidate:WangLonghaiAcademicDegreeAppliedfo
2、r:MasterSpeciality:BiochemistryandMolecularBiologySupervisor:AssociateResearchFellowAPR.02,2015獨創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的論文是我個人在導師指導下進行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得西南科技大學或其它教育機構的學位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均己在論文中作了明確的說明并表示了謝意。關于論文使用和授權的說明本人完全了解西南科技大學有關保留、使用學位
3、論文的規(guī)定，即：學校有權保留學位論文的復印件，允許該論文被查閱和借閱；學?？梢怨荚撜撐牡娜炕虿糠謨热?，可以采用影印、縮印或其他復制手段保存論文。（保密的學位論文在解密后應遵守此規(guī)定）西南科技大學碩士研究生學位論文第I頁摘要γ-氨基丁酸（γ-aminobutyricacid,GABA）代謝途徑是TCA循環(huán)的一個代謝旁路途徑，在動物中樞神經系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用；而植物中，與植物響應各種生物脅迫和非生物脅迫密切相關。琥珀酸半醛脫氫酶SSADH是GABA途徑的一個關鍵酶，不可逆性地催化琥珀酸半醛形成琥珀酸，后者進入三羧酸循環(huán)。已有的研究表明該基因與植物的生長發(fā)育、逆境脅迫應答密
4、切相關。甜高粱是一種重要的生物能源作物，具有多種抗逆特性，因此克隆并鑒定這些優(yōu)良的抗逆基因對于作物的遺傳育種改良具有重要意義。但是SSADH在甜高粱抗逆性中所起的作用，目前尚不清楚。本研究首次從甜高粱中克隆獲得了SSADH基因的編碼區(qū)序列；并對其進行了原核表達和酶活測定、亞細胞定位分析，同時利用農桿菌介導法進行高粱幼胚遺傳轉化，創(chuàng)建基因過表達株系等方面進行了研究。為今后深入研究SSADH基因與甜高粱抗性的關系提供重要依據。主要結果如下：1、利用RT-PCR技術首次從甜高粱Keller中克隆到了SSADH基因編碼區(qū)序列。該序列全長1584bp，編碼527個氨基酸，分子量大約
5、是52.45KD；基因結構與功能在線分析顯示基因具有琥珀酸半醛脫氫酶活性結構域，和一個24個氨基酸的信號肽；與已知物種的SSADH基因編碼區(qū)序列比對發(fā)現，序列相似度較高，僅信號肽部分差異較大。2、構建兩個原核表達載體：一個全長的表達載體pET-28a-SSADH（1584）和截掉信號肽的原核表達載體pET-28a-SSADH（1386），僅pET-28a-SSADH(1386)表達出了SSADH蛋白；通過Ni-瓊脂糖凝膠層析柱純化出目的蛋白；并測出了蛋白的酶活，結果表明蛋白具有琥珀酸半醛脫氫酶的酶活，測得酶活為0.042units/mg蛋白；同時研究發(fā)現加入SSADH酶的
6、抑制劑AMP和ATP后，酶活被抑制。3、構建SSADH基因序列與GFP報告基因的融合表達載體，利用煙草葉片瞬時表達系統(tǒng)進行亞細胞定位分析，激光共聚焦顯微鏡（CLSM）分析結果表明，SSADH定位于線粒體中，與SSADH基因的功能預測相吻合。qRT-PCR分析了6個品種甜高粱的幼葉SSADH基因的表達情況，發(fā)現基因的表達差異不大。4、本實驗通過構建甜高粱SSADH基因的過表達載體pH7WG2D-SSADH，并西南科技大學碩士研究生學位論文第II頁以農桿菌侵染法，轉化高粱BTX-SKU的愈傷組織，以潮霉素作為篩選劑，潮霉素篩選壓50mg/ml、75mg/ml、100mg/ml
7、依次增加，經過三輪篩選，獲得SSADH基因的抗性愈傷；抗性愈傷已經進入再生培養(yǎng)和生根培養(yǎng)。5、實驗通過0mM、100mM、200mM三個濃度梯度的NaCl處理11個不同的高粱種子；統(tǒng)計10天的發(fā)芽情況，并10天后收獲幼苗、測量幼苗根重、根長、苗重和苗長分析高粱的耐鹽性。篩選得到一個相對耐鹽品種泰斯和一個鹽敏感的品種10-80。以上研究結果為更進一步的研究甜高粱SSADH基因在甜高粱抗性特性中的具體功能和甜高粱育種奠定了一定的基礎。關鍵詞：甜高粱琥珀酸半醛脫氫酶原核表達亞細胞定位遺傳轉化西南科技大學碩士研究生學位論文第III頁A
