鴨tlr5分子的原核表達(dá)及其單克隆抗體的制備

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1、一．、、．人前巧式；４號(hào)…旅ｅ‘級(jí)ｇ票爭城巧堿－三癸媒＼＾？？＇苗若叫大手‘備爹ｙａｎｇ＂圓圓Ｖ圓ＴＹ１｜＜＾＾．；碩壬學(xué)化冷文是若；；＾；／＾；；；京＾霉；巧夸＾鴻戶禱來巧賴據(jù)％沒醜餐暫如ＴＬＲ５分子的原核表達(dá)及其單克隆抗體的制各，—＞、楊美秦女、＞《聲心、嘴祭石：Ｖ較．心部兵和葦乂：？．、化，＊＊＇；＇＇＊一．一作’＇．，＇＾把：？＇？＊？‘＜５？，皆茂‘令＂－＾苗雅導(dǎo)教師姓名，揚(yáng)州大學(xué)，江蘇揚(yáng)州，２２ｇ〇〇ｒ：焦新安教授＇＇￣＂Ｘ潘志明教授，揚(yáng)州大學(xué)，江蘇揚(yáng)州，２２５００９．—？＊＾―＾、以產(chǎn)＊

2、Ｊ？．義，，－申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩壬學(xué)科專業(yè)名稱：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)－／；爭，－：論義提巧日期１５５２０１５年５月之．：：２０年月論文答辯日期：為夢(mèng)■學(xué)位授予單位：揚(yáng)州大學(xué)學(xué)位授予日期：２（Ｕ５年６月：／，＇＇■答辯委員會(huì)主席：了護(hù)ｉ、、妓邏耐年６貞灸苗扭．每亡帶；一？ｖ．石奇冥產(chǎn)讀琴一齊覆．：＇．＼１．；渝金和：國無／Ｊ＾為爲(wèi)．成楊美蠢鴨ＴＬＲ５分子的原核表達(dá)及其單克隆抗體的制備１鴨化Ｒ５分子的原核表達(dá)及其單克隆抗體的制備研究生：楊美蠢導(dǎo)師；焦新安教授潘志明教授中文摘要一Ｔｏ－ｋｒｓｌｌ樣受體（Ｔｏｌｌｌｉｅｒｅｃｅｔｏ

3、ＴＬＲｓ）是類跨膜蛋白家族，通過識(shí)別病原相關(guān)分子ｐ，ｈｏ－模式（ＰａｔｅｎａｓｓｏｃｉａｔｅｄｍｏｌｅｃｕｌａｒａｔｅｒｎｓＰＡＭＰｓ）誘導(dǎo)先天性免疫應(yīng)答。ＴＬＲｓ被認(rèn)為ｇｐ，是最有特點(diǎn)的先天性受體。，在宿主抗感染免疫中發(fā)揮重要作用不同的ＴＬ艮Ｓ識(shí)別特定的分子標(biāo)志并且啟動(dòng)先天性免疫應(yīng)答，如ＴＬＲ２和ＴＬＲ３復(fù)合物或ＴＬＲ２和ＴＬＲ６復(fù)合物識(shí)別脂膚或脂蛋白，ＴＬＲ３識(shí)別病毒的雙鏈ＲＮＡ，ＴＬＲ４識(shí)別脂多糖，ＴＬＲ５識(shí)別鞭毛蛋白，８Ｇ－ＤＮＡＴＬＲ７和ＴＬＲ識(shí)別單鏈ＲＮＡ，Ｗ及ＴＬＲ９識(shí)別細(xì)菌的Ｃｐ。５一ＴＬＲ是類限制性表達(dá)受體、／巨帷細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞，主

4、要表這在上皮細(xì)胞單核（ＤＣ）等細(xì)胞的表面。鞭毛蛋白是ＴＬＲ５的特異性配體，ＴＬＲ５識(shí)別鞭毛蛋白后，啟動(dòng)Ｄ８８ＮＦ－ｋＢ）Ｍ。ｙ依賴的信號(hào)通路，激活轉(zhuǎn)錄因子（誘導(dǎo)前炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生目前，針對(duì)先天性免疫應(yīng)答的研究主要Ｗ人或小鼠為模型，而對(duì)于家禽的研究則較為少見，主要是由于缺乏與家禽相關(guān)的生物試劑材料。因此，本研究構(gòu)建表達(dá)了鴨ＴＬＲ５分子的胞外區(qū)（ＥＣＤ）片段，并制備了針對(duì)ＴＬＲ５（ＥＣＤ）的單克隆抗體，Ｗ期為家禽先天性免疫應(yīng)答研究提供材料。Ｊ本研究ｌＴＬＲ５ｃＤＮＡ為ＤＮＡ，設(shè)計(jì)合成引，＾＾實(shí)驗(yàn)室前期制備的鴨模板物利用高保真聚合酶擴(kuò)增鴨ＴＬＲ５巧ＣＤ）基因片段，片

5、段大小為１６０８ｂｐ。將擴(kuò)増的目的基因片段連接－ＭＤ２０－Ｔ克隆載體于Ｐ，經(jīng)篩選鑒定正確后，將目的基因分別連接于原核表達(dá)載體ｐＣｏｌｄ１－ＧＥＸ－６－－和ｐｐｌ，經(jīng)篩選鑒定正確后，分別將構(gòu)建的原核重組質(zhì)粒ｐＣｏｌｄＩＴＬＲ５和－－－－－ＧＥＸ６ｐｌＴＬＲ５轉(zhuǎn)化宿主大腸桿苗ＢＬ２１，從而構(gòu)建出重組菌ｐＣｏｌｄ１ＴＬ民５／ＢＬ２１和ｐ－ＧＥＸ６－ｌ－ｐｐＴＬＲ５／ＢＬ２１〇－－Ｃｏ－－－將重組菌ｌｄ１ＴＬＲ５／ＢＬ２１和ＧＥＸ６ｌＴＬＲ５／ＢＬ２１分別接種于含有Ａｍ的ＬＢｐｐｐｐ液體培養(yǎng)基中，加入ＩＰＴＧ誘導(dǎo)重組融合蛋白的表達(dá)，收集菌體，超聲波裂解茵體，離

6、也－ＰＡＧＥ凝膠電泳－后分別收集上清和沉淀進(jìn)行ＳＤＳ，根據(jù)電泳結(jié)果判定，重組融合蛋白ｒＨｉｓＴＬＲ５和ｒＧｓｔ－ＴＬＲ５均表達(dá)在包涵體中。ｒＨ－－Ｗ重組融合蛋白ｉｓＴＬＲ５為免疫原免疫６８周齡的雌性ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠，應(yīng)用Ｂ淋巴揚(yáng)州大學(xué)碩±學(xué)位論文Ｉ細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，通過間接ＥＵＳＡ方法和２次亞克隆篩選，獲得６株能夠穩(wěn)定的分泌抗ＴＬＲ５單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為１Ｃ１０、他５、純９、５Ｂ１１、５巧和瓜７。對(duì)獲得的６株細(xì)胞株分別進(jìn)行培養(yǎng)上清效價(jià)、腹水效價(jià)和抗體亞類測(cè)定。結(jié)果顯示，４６１Ｃ１０、４Ｂ５、５Ｂ９和６Ｄ７的培養(yǎng)上清效價(jià)均在１０Ｗ上；純１１株

7、腹水效價(jià)低于１０，其余７均在１０。抗體亞類鑒定顯示，５巧株為ＩｇＧｌ，其余５株均為ＩｇＭ。對(duì)收集的腹水單克隆抗體進(jìn)行透析處理，然后用ｒＰｒｏｔｅｉｎＡＳｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ親和層析柱純化－ＰＡＧＥ凝膠電６，收集純化后抗體進(jìn)行ＳＤＳ泳，電泳顯示株抗體的純化效果整體較Ｃ－－好。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ結(jié)果顯示，每株抗體均與經(jīng)誘導(dǎo)的重組菌ｐｏｌｄ１ＴＬＲ５／ＢＬ２１和一Ｇ