t7噬菌體衣殼蛋白p11的原核表達(dá)、 純化及其單克隆抗體的制備

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1、T7噬菌體衣殼蛋白P11的原核表達(dá)、純化及其單克隆抗體的制備【關(guān)鍵詞】T7噬菌體P11蛋白核表達(dá)單克隆抗體T7噬菌體是一種感染大腸桿菌的烈性噬菌體［1］,基因組為線(xiàn)狀雙鏈DNA,長(zhǎng)39936bp。其衣殼蛋白包括主要頭蛋白PlOA、次要頭蛋白P1OB、頸圈蛋白P8、尾蛋白P11、P12和尾絲蛋白P17［2,3］。T7噬菌體作為一種常見(jiàn)的展示系統(tǒng)［4-6］,因其載體容量大,插入片段穩(wěn)定,洗滌條件靈活,生長(zhǎng)周期短而被廣泛使用。為進(jìn)一步研究T7噬菌體尾蛋白P11蛋白結(jié)構(gòu)和功能,并為建立T7噬菌體快速準(zhǔn)確的檢測(cè)方法奠定基礎(chǔ),我們進(jìn)行了原核表達(dá)、純化P11蛋白并制備出具有良好

2、特異性的mAb。　　1材料和方法　　1.1材料　　質(zhì)粒pET28a(+)、T7select103bcontrol,大腸桿菌Top10株,大腸桿菌BL21（DE3）以及Sp2/0細(xì)胞均由本室保存。限制性?xún)?nèi)切酶NdeⅠ和BamHⅠ均購(gòu)自大連寶生物公司。膠回收試劑盒購(gòu)自華舜生物工程有限公司。NiNTAHisBindresin購(gòu)自Amersham公司。　　HRP羊抗鼠IgG和Ig亞類(lèi)（型）鑒定試劑盒Sigma公司產(chǎn)品。BALB/c小鼠由本研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。　　1.2方法　　1.2.1重組原核表達(dá)載體的構(gòu)建　　以T7select103bcontrol質(zhì)粒為模

3、板,加入針對(duì)G11基因的特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。上游引物為:5′ggaattccatatgatgcgctcatacgatatgaac3′（劃線(xiàn)處為NdeI酶切位點(diǎn)）下游引物為:5′cgggatccttagcgagtcagtagaccag3′（劃線(xiàn)處為BamHI酶切位點(diǎn)）。擴(kuò)增反應(yīng)的條件為:94℃變性5min,然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán):94℃30s,58℃45s,72℃60s,最后72℃延伸8min。用膠回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物,用NdeI和BamHI雙酶切PCR產(chǎn)物和pET28a(+),T4DNA連接酶連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10株,抽取質(zhì)粒,NdeI和BamH

4、I雙酶切鑒定并測(cè)序確認(rèn)正確,成功構(gòu)建重組表達(dá)載體pET28a(+)/G11?！　?.2.2重組P11蛋白的表達(dá)及純化　　將pET28a(+)/G11轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)。用異丙基βD硫代半乳糖苷（IPTG）分別誘導(dǎo)表達(dá)4、6、8h,通過(guò)SDSPAGE分析比較誘導(dǎo)前后結(jié)果。挑單克隆接種于含50mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基中,37℃震蕩培養(yǎng)過(guò)夜,按1∶100轉(zhuǎn)接到200mL培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)至A600為0.6時(shí),加入IPTG至終濃度為0.4mmol/L,30℃誘導(dǎo)表達(dá)4h。收集菌液,以8000r/min離心10min收集菌體,用緩沖液A（pH7

5、.4、20mmol/LPB、0.5mol/LNaCl、1mmol/LPMSF）重懸細(xì)菌沉淀,經(jīng)超聲破碎細(xì)菌后,以12000r/min離心10min。取上清,采用DuoFlomol/LPB、0.5mol/LNaCl、0.5mol/Limidazole）梯度洗脫。收集洗脫峰,120g/LSDSPAGE鑒定純化效果?！　?.2.3動(dòng)物免疫　　用400μL純化的p11蛋白（1.0g/L）稀釋于6000μLPBS（0.1mol/LPB、0.15mol/LNaCl）并與等量完全弗氏佐劑混合充分乳化,多點(diǎn)皮下注射免疫BALB/c小鼠（50μg/只）。1個(gè)月后,經(jīng)腹腔注射加強(qiáng)

6、免疫,用不完全弗氏佐劑充分乳化抗原,注射劑量同前,后每隔2周分別進(jìn)行第3次和第4次加強(qiáng)免疫?！　?.2.4細(xì)胞融合與抗體制備　　ELISA法檢測(cè)抗血清的效價(jià),取效價(jià)最高的老鼠,脾內(nèi)注射10μg抗原加強(qiáng)免疫,4d后,取脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞Sp2/0融合［7］。用間接ELISA法［8］篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株。經(jīng)3次有限稀釋法克隆化后,選擇1株mAb持續(xù)分泌陽(yáng)性的雜交瘤細(xì)胞并擴(kuò)大培養(yǎng)準(zhǔn)備腹腔注射小鼠。接種雜交瘤細(xì)胞前1周,小鼠腹腔注射0.5mL液體石蠟。接種時(shí)離心收集雜交瘤細(xì)胞,用不完全培養(yǎng)液懸浮并混勻,將細(xì)胞數(shù)調(diào)至(1～2)×109/L,每只小鼠腹腔注射0.5mL,1周后

7、小鼠腹部明顯腫脹,消毒下腹部皮膚后,抽取腹水,獲得腹水經(jīng)3000r/min離心15min,收集上清。硫酸銨法初步純化腹水,以用于后續(xù)檢測(cè)?！　?.2.5mAb的效價(jià)和亞類(lèi)鑒定　?、傩r(jià)測(cè)定:采用間接ELISA法。用PBS稀釋10μLP11蛋白（1mg/L）包被聚苯乙烯板。一抗為稀釋的腹水樣本,二抗為1∶1000的HRP羊抗鼠IgG,經(jīng)ABTS底物顯色后,于波長(zhǎng)405nm測(cè)定A值。②Ig亞類(lèi)（型）的鑒定：間接ELISA法（參照試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行）。③特異性鑒定:Ab反應(yīng)過(guò)夜,再與HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG37℃孵育2h,經(jīng)顯色液顯色后壓片觀察結(jié)果?！　?結(jié)果　　2.

8、1重組質(zhì)粒