t7噬菌體衣殼蛋白p11的原核表達、 純化及其單

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1、T7噬菌體衣殼蛋白P11的原核表達、純化及其單【摘要】目的:表達、純化T7噬菌體衣殼蛋白P11,并制備其單克隆抗體（mAb）。方法:克隆并表達T7噬菌體P11蛋白,其氨基端帶有6His標簽。純化后的蛋白免疫BALB/c小鼠,經(jīng)融合、篩選制備特異性mAb。結果:成功表達了P11蛋白。SDSPAGE顯示所表達蛋白的相對分子質量（Mr）約為27000。獲得了1株穩(wěn)定分泌抗P11抗體的雜交瘤細胞株（2G11）,其分泌的mAb的Ig亞類（型）為IgG2b。ELISA檢測,對應腹水mAb的效價為1∶8.1×105。SF）重懸細菌沉淀,經(jīng)超聲破碎細菌后,以12000r/mi

2、n離心10min。取上清,采用DuoFlomol/LPB、0.5mol/LNaCl、0.5mol/Limidazole）梯度洗脫。收集洗脫峰,120g/LSDSPAGE鑒定純化效果。　　1.2.3動物免疫　　用400μL純化的p11蛋白（1.0g/L）稀釋于6000μLPBS（0.1mol/LPB、0.15mol/LNaCl）并與等量完全弗氏佐劑混合充分乳化,多點皮下注射免疫BALB/c小鼠（50μg/只）。1個月后,經(jīng)腹腔注射加強免疫,用不完全弗氏佐劑充分乳化抗原,注射劑量同前,后每隔2周分別進行第3次和第4次加強免疫。　　1.2.4細胞融合與抗體制備　　E

3、LISA法檢測抗血清的效價,取效價最高的老鼠,脾內注射10μg抗原加強免疫,4d后,取脾細胞與骨髓瘤細胞Sp2/0融合［7］。用間接ELISA法［8］篩選陽性雜交瘤細胞株。經(jīng)3次有限稀釋法克隆化后,選擇1株mAb持續(xù)分泌陽性的雜交瘤細胞并擴大培養(yǎng)準備腹腔注射小鼠。接種雜交瘤細胞前1周,小鼠腹腔注射0.5mL液體石蠟。接種時離心收集雜交瘤細胞,用不完全培養(yǎng)液懸浮并混勻,將細胞數(shù)調至(1～2)×109/L,每只小鼠腹腔注射0.5mL,1周后小鼠腹部明顯腫脹,消毒下腹部皮膚后,抽取腹水,獲得腹水經(jīng)3000r/min離心15min,收集上清。硫酸銨法初步純化腹水,以用于后

4、續(xù)檢測。　　1.2.5mAb的效價和亞類鑒定　?、傩r測定:采用間接ELISA法。用PBS稀釋10μLP11蛋白（1mg/L）包被聚苯乙烯板。一抗為稀釋的腹水樣本,二抗為1∶1000的HRP羊抗鼠IgG,經(jīng)ABTS底物顯色后,于波長405nm測定A值。②Ig亞類（型）的鑒定：間接ELISA法（參照試劑盒的說明書進行）。③特異性鑒定:Ab反應過夜,再與HRP標記的羊抗鼠IgG37℃孵育2h,經(jīng)顯色液顯色后壓片觀察結果。　　2結果　　2.1重組質粒的鑒定　　重組表達質粒pET28a(+)/G11經(jīng)NdeI和BamHI酶切后分別出現(xiàn)5927、598bp的電泳條帶（圖

5、1）,與預期大小相符,測序結果與文獻發(fā)表的序列一致,未發(fā)現(xiàn)突變堿基存在,說明重組原核表達載體構建正確?！　?.2G11基因在大腸桿菌BL21(DE3)中的表達和純化　　將重組表達質粒pET28a(+)/G11轉化大腸桿菌BL21（DE3）后,經(jīng)IPTG誘導表達表達4、6和8h。表達產物經(jīng)SDSPAGE后,在Mr約27000處可見1條明顯的蛋白帶（圖2）。該蛋白的氨基端帶有Histag,大量誘導表達Ni2+柱親和層析純化后,用BCA法定量,可溶性表達蛋白含量為1.0mg/L。　　2.3抗P11蛋白mAb的制備和初步鑒定　　血清抗體效價最高的免疫小鼠的脾細胞進行

6、融合,結果篩選到1株陽性克隆,命名為2G11。經(jīng)ELISA檢測,1株mAb腹水的效價為1∶8.1×105。其Ig亞類為IgG2b、r為27000處T7噬菌體蛋白和重組P11蛋白有一明顯條帶,而未經(jīng)誘導菌體蛋白、P10his蛋白和T4噬菌體蛋白則無此反應（圖3）。　　3討論本實驗中我們構建了原核表達載體pET28a(+)/G11,鑒定正確后轉化至大腸桿菌BL21（DE3）表達羧基端含6×His標簽的可溶性融合蛋白。利用6×His標簽和鎳離子特異性螯合的特性純化,得到高純度的目的蛋白。以純化P11蛋白為抗原,通過雜交瘤技術成功獲得了抗P11的mAb。　　T7噬菌體

7、具有的強大的外源蛋白或多肽展示能力,已經(jīng)被廣泛應用于cDNA文庫展示,如最近就有人利用T7噬菌體展示前列腺癌組織的cDNA文庫［9］,然后利用文庫技術與噬菌體芯片技術結合找到了一些前列腺癌的自身抗原及自身抗體。在實際工作中,我們發(fā)現(xiàn)制備T7噬菌體芯片時,需要對展示不同多肽的噬菌體進行定量檢測（未發(fā)表資料）,如果能夠首先在芯片上點上抗T7噬菌體的抗體,然后再點上T7噬菌體,那將有望使芯片上的T7噬菌體較均一;而且由于P11位于T7噬菌體的尾部（圖4）,這樣的點樣方式,也將使融合于P10的蛋白或多肽更加有效的展示,進而使篩選更加有效。此外,關于T7噬菌體尾蛋白P11參

8、與包裝的具