T7噬菌體衣殼蛋白P11原核表達(dá)、純化及其單克隆抗體制備

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1、T7噬菌體衣殼蛋白P11原核表達(dá)、純化及其單克隆抗體制備【摘要】目的：表達(dá)、純化T7噬菌體衣殼蛋白P11,并制備其單克隆抗體(mAb)o方法：克隆并表達(dá)T7噬菌體P11蛋白，其氨基端帶有6His標(biāo)簽。純化后的蛋白免疫BALB/c小鼠，經(jīng)融合、篩選制備特異性mAbo結(jié)果：成功表達(dá)了P11蛋白。SDSPAGE顯示所表達(dá)蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)約為27000o獲得了1株穩(wěn)定分泌抗P11抗體的雜交瘤細(xì)胞株(2G11),其分泌的mAb的Ig亞類(型)為IgG2b°ELISA檢測(cè)，對(duì)應(yīng)腹水mAb的效價(jià)為1：8.1X105oWesternblo

2、t結(jié)果顯示抗PllmAb具有良好的特異性。結(jié)論：成功地制備了P11蛋白及其mAbo【關(guān)鍵詞】T7噬菌體P11蛋白核表達(dá)單克隆抗體T7噬菌體是一種感染大腸桿菌的烈性噬菌體[1],基因組為線狀雙鏈DNA,長39936bp。其衣殼蛋白包括主要頭蛋白P10A、次要頭蛋白P10B、頸圈蛋白P8、尾蛋白P11、P12和尾絲蛋白P17[2,3]。T7噬菌體作為一種常見的展示系統(tǒng)[4-6],因其載體容量大，插入片段穩(wěn)定，洗滌條件靈活，生長周期短而被廣泛使用。為進(jìn)一步研究T7噬菌體尾蛋白P11蛋白結(jié)構(gòu)和功能，并為建立T7噬菌體快速準(zhǔn)確的檢測(cè)方法奠定基

3、礎(chǔ)，我們進(jìn)行了原核表達(dá)、純化P11蛋白并制備出具有良好特異性的mAbo1材料和方法1.1材料質(zhì)粒pET28a（+）xT7select103bcontrol,大腸桿菌ToplO株，大腸桿菌BL21（DE3）以及Sp2/0細(xì)胞均由本室保存。限制性內(nèi)切酶NdeI和BamHI均購自大連寶生物公司。膠回收試劑盒購自華舜生物工程有限公司。NiNTAHisBindresin購自Amersham公司。HRP羊抗鼠IgG和Ig亞類（型）鑒定試劑盒Sigma公司產(chǎn)品。BALB/c小鼠由本研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。1.2方法1.2.1重組原核表達(dá)載體的構(gòu)建

4、以T7select103bcontrol質(zhì)粒為模板，加入針對(duì)G11基因的特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。上游引物為：5fggaattccatatgatgcgcteataegatatgaac3'（劃線處為NdeI酶切位點(diǎn)）下游引物為：5’egggateettagegagtcagtagaccag3Z（戈U線處為BamHI酶切位點(diǎn)）。擴(kuò)增反應(yīng)的條件為：94￡變性5min,然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)：94°C30s,58°C45s,72°C60s,最后72°C延伸8mino用膠回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物，用NdeI和BamHI雙酶切PCR產(chǎn)物和pET28a(

5、+),T4DNA連接酶連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplO株，抽取質(zhì)粒，NdeI和BamHI雙酶切鑒定并測(cè)序確認(rèn)正確，成功構(gòu)建重組表達(dá)載體pET28a(+)/Gilo1.2.2重組P11蛋白的表達(dá)及純化將pET28a(+)/Gl1轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)O用異丙基BD硫代半乳糖昔(IPTG)分別誘導(dǎo)表達(dá)4、6、8h,通過SDSPAGE分析比較誘導(dǎo)前后結(jié)果。挑單克隆接種于含50mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37匸震蕩培養(yǎng)過夜，按1：100轉(zhuǎn)接到200mL培養(yǎng)基中，379培養(yǎng)至A600為0.6時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.4mmol/L

6、,3(TC誘導(dǎo)表達(dá)4h。收集菌液，以8000r/min離心10min收集菌體，用緩沖液A(pH7?4、20mmol/LPB.0.5mol/LNaCl.1mmol/LPMSF)重懸細(xì)菌沉淀，經(jīng)超聲破碎細(xì)菌后，以12000r/min離心10mino取上清，采用DuoFlow系統(tǒng)(BioRad)NiNTA親和柱層析，緩沖液B(pH7?4、20mmol/LPB.0.5mol/LNaCl>0.5mol/Limidazole)梯度洗脫。收集洗脫峰，120g/LSDSPAGE鑒定純化效果。1.2.3動(dòng)物免疫用400uL純化的pll蛋白(1.0g/

7、L)稀釋于6000PLPBS(0.1mol/LPB、0.15mol/LNaCl)并與等量完全弗氏佐劑混合充分乳化，多點(diǎn)皮下注射免疫BALB/c小鼠（50Pg/只）。1個(gè)月后，經(jīng)腹腔注射加強(qiáng)免疫，用不完全弗氏佐劑充分乳化抗原，注射劑量同前，后每隔2周分別進(jìn)行第3次和第4次加強(qiáng)免疫。1.2.4細(xì)胞融合與抗體制備ELISA法檢測(cè)抗血清的效價(jià)，取效價(jià)最高的老鼠，脾內(nèi)注射10Ug抗原加強(qiáng)免疫，4d后，取脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞Sp2/0融合［7］。用間接ELISA法［8］篩選陽性雜交瘤細(xì)胞株。經(jīng)3次有限稀釋法克隆化后，選擇1株mAb持續(xù)分泌陽性的雜

8、交瘤細(xì)胞并擴(kuò)大培養(yǎng)準(zhǔn)備腹腔注射小鼠。接種雜交瘤細(xì)胞前1周，小鼠腹腔注射0.5mL液體石蠟。接種時(shí)離心收集雜交瘤細(xì)胞，用不完全培養(yǎng)液懸浮并混勻，將細(xì)胞數(shù)調(diào)至（1?2）X109/L,每只小鼠腹腔注射0.5mL,1周后小鼠腹部明顯腫脹，消毒