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1、分類號(hào)：R392.11密級(jí)：UDC：610學(xué)校代碼：11065碩士學(xué)位論文Tim-3和Th17細(xì)胞在免疫性肝損傷中作用及相關(guān)機(jī)制的研究張文指導(dǎo)教師張蓓副教授學(xué)科專業(yè)名稱免疫學(xué)論文答辯日期2015年5月30日摘要目的用刀豆蛋白A（ConA）建立免疫性肝損傷模型，探討Tim-3和Th17細(xì)胞相關(guān)因子在發(fā)病過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化及意義；靶向干預(yù)Tim-3通路后探討其對(duì)Th17細(xì)胞的影響。方法60只Wistar雄性大鼠隨機(jī)分為兩組，即模型組（50只）和對(duì)照組（10只）。模型組大鼠尾靜脈注射12.5mg/kgConA，每周1次連續(xù)8周。對(duì)照組大鼠
2、尾靜脈注射無(wú)菌PBS，每周1次連續(xù)8周。隨機(jī)從模型組中取10只大鼠，在第0周（0w）、第2周（2w）、第4周（4w）、第6周（6w）、第8周（8w）時(shí)對(duì)大鼠實(shí)施體外心尖取血1.5ml，分離血清后于-20℃?zhèn)溆谩?周后隨機(jī)從模型組中取出20只大鼠，酒精浸泡20分鐘后無(wú)菌取脾制備脾淋巴細(xì)胞。在脾淋巴細(xì)胞中加入Tim-3的單克隆抗體來(lái)阻斷Tim-3通路；用Tim-3的重組配體來(lái)激活Tim-3通路，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，收集細(xì)胞上清液于-20℃保存。生化分析法測(cè)血清中ALT、AST和ALB的表達(dá)；HE染色觀察肝臟組織的病理
3、變化；ELISA法測(cè)血清中Tim-3、IL-17A、IL-6、TGF-β和IL-23的表達(dá)及上清液中IL-17A和IL-6的表達(dá)；免疫組化法測(cè)肝臟組織中Tim-3、IL-17A和ROR-γt蛋白的表達(dá)；實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)各組脾淋巴細(xì)胞ROR-γtmRNA的表達(dá)。結(jié)果與對(duì)照組相比，模型組大鼠的ALT及AST水平均顯著升高(P<0.05)，ALB水平顯著下降(P<0.05)。在模型組的不同階段中，HE染色檢測(cè)肝組織可見(jiàn)4w時(shí)開(kāi)始偶見(jiàn)假小葉，6w時(shí)量明顯增多，而8w時(shí)發(fā)現(xiàn)有明顯的炎性細(xì)胞和肝臟損傷，鏡下假小葉較多見(jiàn)；ELISA法檢測(cè)相應(yīng)的
4、細(xì)胞因子可見(jiàn)IL-17A、IL-6、IL-23的動(dòng)態(tài)趨勢(shì)是先升高，4w后開(kāi)始降低(P<0.05)；Tim-3的動(dòng)態(tài)趨勢(shì)則是先降低，4w以后開(kāi)始升高(P<0.05)；免疫組化檢測(cè)相應(yīng)的蛋白可見(jiàn)4w時(shí)IL-17A和ROR-γt蛋白的水平明顯升高，而Tim-3蛋白的水平明顯降低。靶向干預(yù)后，與阻斷對(duì)照組相比，阻斷實(shí)驗(yàn)組中IL-17A和IL-6的水平升高(P<0.05)；與激活對(duì)照組相比，激活實(shí)驗(yàn)組中IL-17A和IL-6的水平降低；實(shí)時(shí)定量PCR顯示與阻斷對(duì)照組相比，阻斷實(shí)驗(yàn)組中ROR-γtmRNA的水平明顯增加(P<0.05)。結(jié)論T
5、im-3及Th17細(xì)胞參與了免疫性肝損傷的發(fā)生發(fā)展，其水平的變化可以在一定程度上反應(yīng)病情的嚴(yán)重程度，可望為免疫性肝損傷發(fā)生機(jī)制提供新的線索；免疫調(diào)控Tim-3通路可通過(guò)影響Th17細(xì)胞效應(yīng)，進(jìn)而影響肝損傷的程度，以期為臨床治療提供新的依據(jù)。碩士研究生張文（免疫學(xué)）指導(dǎo)教師張蓓副教授關(guān)鍵詞：刀豆蛋白A；免疫性肝損傷；Tim-3；IL-17AAbstractObjectiveToestablishtheimmunologicalhepaticinjurymodelbyConAandinvestigatethedynamicchange
6、sofTim-3andTh17cellsassociatedcytokinesandexploretheeffectofinterventionTim-3pathwayonTh17cells.MethodsSixtymaleWistarratswererandomlydividedintomodelgroup(n=50)andcontrolgroup(n=10).Modelgroupwasivinjectedwith12.5mg/kgConAonceaweekforeightconsecutiveweekswhilecontrol
7、groupwasivinjectedwithPBSonceaweekforeightconsecutiveweeks.Taken1.5mlbloodbyapexcordisfrommodelgroupwithtaken10ratsrandomlyatthezero,thesecond,thefourth,thesixthandtheeighthweek,thenseparatedtheserumandstoredin-20℃.Taken20ratsrandomfromthemodelgroupandgotsterilespleen
8、sthenpreparedspleenlymphocytes.BlockingTim-3pathwaybyanti-Tim-3whileactivatingthispathwaybyrecombinantligand,cultured72hunde
