云南蘿芙木pnae基因轉(zhuǎn)錄分析及原核表達(dá)

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1、分類號：密級：學(xué)校代號：１０５３８學(xué)號：２２００８３３７？劣弁裝卡４辛ＣｅｎｔｒａｌＳｏｕｔｈＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＦｏｒｅｓｔｒｙ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ碩±學(xué)術(shù)學(xué)位論文云南蘿芙木公基因轉(zhuǎn)錄分析及原核表達(dá)作者姓名：李雅娟導(dǎo)師姓名：曹福祥培養(yǎng)學(xué)院：生命科學(xué)院學(xué)科名稱：生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究方向：生物制藥提交日期：２０１５年５月Ｔ＊ｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＡｎａｌｙｓｉｓａｎｄＰｒｏｋａｒｙｏｔｉｃＥｘｐｉｅｉｓｓｉｏｎｏｆ?wèi)粼酰牐牵澹睿澹牐椋睿崳姡遥幔酰觯铮欤辏椋幔酰睿睿幔睿?/p>

2、ｎｓｉｓＴｓｉａｎｂｙｇＢｙｌｉＹａｕａｎｊＡ化ｅｓｉｓｓｕｂｍｉｔｔｅｄｉｎａｒｔｉａｌ扣ＩｆｉｌｌｍｅｎｔｏｆｔｈｅｐＲｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓｆｏｒｔｈｅｄｅｇｒｅｅｏｆＭａｓｔｅｒｏｆＳｃｉｅｎｃｅＳｕｐｅｒｖｉｓｏｒＰｒｏｆｅｓｓｏｒＣａｏＦｕｘｉａｎｇＣｅｎｔｒａｌＳｏｕｔｈＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＦｏｒｅｓｔｒｙａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ４９８ＳｈａｏｓｈａｎＳｏｕｔｈ民ｏａｄ，ＴＴｉａｎｘｉｎＤｉｓｔｒｉｃｔＣｈａｎｓｈａＨｕｎａｎ４１０００４Ｐ．Ｒ．ＣＨＩＮＡｇ，Ｊ

3、ｕｎｅ，２０１５中南＃皮種我夫緣學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所呈交的論文是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下獨立進(jìn)行研究所取得的研究成果，。除了文中特別加標(biāo)注引用的內(nèi)容外本論文不包含任何其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫的成果作品，也不包含為獲得中南林業(yè)科技大學(xué)或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書所使用過的材料，均。對本文的研究作出重要貢獻(xiàn)的個人和集體已在文中Ｗ明確方式表明。本人完全意識到本聲明的法律后果由本人承擔(dān)。作者簽名：年月Ａ曰＾中齋妹史種我夫營學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學(xué)位論文作者完全了解學(xué)校有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，同意學(xué)校保留并向國家有關(guān)部

4、口或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件或電子版，允許論文被查閱或借閱。本人授權(quán)中南林業(yè)科技大學(xué)可Ｗ將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，可Ｗ采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存和匯編本學(xué)位論文。本學(xué)位論文屬于；１□，在年解密后適用本授權(quán)書。、保密２、不保密口。＂＂（請您在Ｗ上相應(yīng)方框打Ｖ）心＾作者簽名：導(dǎo)誰名：年Ｖ月皆日公摘要云南蘿芙木訴ｆｌｙｉｍｎａｗｅｎｓｂＴｓｉａｎｇ）因其含有多種功能的生物堿而被廣泛應(yīng)用于藥物提取。近年來隨著蘿芙木藥用價值的不斷開發(fā)，其資源被迅速消耗，再生速度遠(yuǎn)跟不上消耗速度。為了提高云南蘿芙木的資源利

5、用率，研究其重要生物堿的代謝途徑大有必要。ａｍａ一ｌｉｎｅ）是在舌南蘿芙木的藥用成分中，阿嗎靈（其中個重要的生物堿，ｊ聚精液素醇酷酶ＰＮＡＥ（ｐｏｌｙｎｅｕｒｉｄｉｎｅａｌｄｅｈｙｄｅｅｓｔｅｒａｓｅ）則是阿嗎靈合成途經(jīng)中的關(guān)鍵酶。巧心￡基因的表達(dá)調(diào)控模式可能與阿嗎靈的生成具有重要聯(lián)系。本論文在云南蘿芙木中對戶化４￡基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平分析，同時在體外進(jìn)巧原核表達(dá)研究，為后期深入研究ＰＮＡＥ蛋白酶在阿嗎靈合成途徑中的功能奠定基礎(chǔ)。本研究主要內(nèi)容如下；１）云南蘿芙木外植體脫毒及組織培養(yǎng)條件研究。２）戶撕４￡基因克隆及序列分析。云南蘿芙木成年植株葉片為原

6、料提取ＲＮＡ、－ＰＣＲ擴(kuò)增ＰＮＡＥ基因片段反轉(zhuǎn)錄、ＲＴ。純化ＰＣＲ產(chǎn)物之后進(jìn)行ＴＡ克隆，獲得７９５ｂｐ擴(kuò)增片段。進(jìn)行生物信息學(xué)分析，預(yù)測ＰＮＡＥ蛋白酶的二級結(jié)構(gòu)。分析結(jié)果表明該蛋白有２６５個氨基酸組成，ａａ螺旋、Ｐ轉(zhuǎn)角是該蛋白質(zhì)整體結(jié)構(gòu)中的主要元件，ａ螺旋散布于整個蛋白質(zhì)中，且該蛋白屬于親水性蛋白。＞３）分析云南蘿芙木不同組織中／％４￡基因的表達(dá)豐度。根據(jù)基因序列設(shè)計引物，選用１８ｓＲＮＡ作為內(nèi)參基因，選取成年云南蘿芙木植株根、莖、老葉、嫩葉、花５個不同組織，組培幼苗根、莖、葉３個組織部位分別作為樣本進(jìn)行相對定量分析，研究其在不同姐織中的表達(dá)情況?；^數(shù)

7、據(jù)出到結(jié)論；ＰＮＡＥ基因在成年植。株各個組織部位中表達(dá)并無明顯差異，在組培幼苗中同樣無明顯差異４）ＰＮＡＥ酶的原核表達(dá)。構(gòu)建原核表達(dá)載體ＰＮＡＥ，對酶的原核表達(dá)條件進(jìn)行了初步探索。對培養(yǎng)基的成分、苗的種齡、茜液的接種量、搖瓶裝液量、振蕩器轉(zhuǎn)速、誘導(dǎo)劑ＩＰＴＧ濃度、誘導(dǎo)時機(jī)、誘導(dǎo)時間、培養(yǎng)與誘導(dǎo)溫度等進(jìn)行嘗試，－－獲得高效表達(dá)重組ＰＮＡＥ蛋白的誘導(dǎo)條件：ＰＧＥＸ６Ｐ１為表達(dá)載體，ＢＬ２１為表°達(dá)菌株，３７Ｃ，