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《擬穴青蟹過敏原精氨酸激酶的抗原表位分析研究》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、學(xué)校編碼10390分類號0512學(xué)號201211710027密級%'iK^碩士學(xué)位論文擬穴青蟹過敏原精氨酸激酶的抗原表位分析研究指導(dǎo)教師:劉光明教授作者姓名:楊陽申請學(xué)位級別:fi±學(xué)科專業(yè):生物學(xué)研究方向：微生物學(xué)論文提交日期:2015年4月7日論文答辯日期:2015年6月5日學(xué)位授予單位:集美大學(xué)學(xué)位授予曰期:2015年6月答辯委員會主席:論文評閱人:學(xué)術(shù)誠信聲明茲呈交的學(xué)位論文，是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下獨立進行的研宄工作及??！i'j研允成果。除文中特別加以標注和致謝的地方外，論文中不包含其他1、人或集體己經(jīng)發(fā)表或
2、撰寫過的研宄成果。本人依法享有和承擔由此論文產(chǎn)生的權(quán)利和責(zé)任。聲明人（簽名）時間：目…問保護知識產(chǎn)權(quán)聲明本人完全了解集美大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即:學(xué)校U權(quán)保m送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱，可以米用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。同意集美大學(xué)可以川f同方式在不同媒體上發(fā)表、傳播學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容。#C簽名）：加？碩士學(xué)位論文擬穴青蟹過敏原精氨酸激酶的抗原表位分析研究AnalysisandCharacterizationofAntigenicEpitopesofArgi
3、nineKinasefromScyllaparamamosain學(xué)科門類：理學(xué)作者姓名：楊陽指導(dǎo)教師：劉光明教授學(xué)科專業(yè)：生物學(xué)研究方向：微生物學(xué)學(xué)位授予單位：集美大學(xué)論文答辯日期：2015年6月5日擬穴青蟹過敏原精氨酸激酶的抗原表位分析研究摘要食物過敏作為食品安全的熱點問題在全球引起了廣泛關(guān)注，甲殼類動物是聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）公布的八大類過敏食物之一。蟹類等甲殼類水產(chǎn)品味道鮮美、營養(yǎng)豐富，是重要的水產(chǎn)資源；但隨著蟹類消費量的增加，因食用蟹類而導(dǎo)致過敏的報道也隨之增多。精氨酸激酶（Argininekinase
4、，AK）是存在于甲殼類和軟體類動物的泛過敏原，對其抗原表位的全面了解能夠為開發(fā)低致敏食品和甲殼類過敏疾病的診斷治療提供依據(jù)。本文首先從擬穴青蟹（Scyllaparamamosain）肌肉中純化得到AK，通過體外模擬胃液降解AK，降解產(chǎn)物的免疫活性檢測結(jié)果表明其降解產(chǎn)物仍具有較強的免疫原性；通過高效液相色譜（highperformanceliquidchromatography，HPLC）對AK的胃液消化產(chǎn)物進行分離純化，得到具有IgG/IgE結(jié)合活性的5個肽段。分別采用天然AK和分段表達產(chǎn)物rAK1（AA：87-
5、186）、rAK2（AA：172-265）作為抗原建立小鼠過敏模型，以確定AK抗原表位的優(yōu)勢區(qū)域，結(jié)果顯示天然AK組和rAK1組的小鼠血清特異性IgE、Th2型細胞因子IL-4和IL-13均顯著升高，表明天然AK和rAK1能夠誘導(dǎo)小鼠過敏反應(yīng)，提示rAK1為AK的抗原表位優(yōu)勢區(qū)。采用純化AK免疫新西蘭大白兔獲得兔抗擬穴青蟹AK特異性抗血清，通過ProteinA柱層析得到純化的兔抗擬穴青蟹AKIgG，以純化的IgG為靶蛋白對噬菌體展示隨機十二肽庫進行生物淘選，獲得與抗原特異性結(jié)合的5個肽段。利用LocaPep軟件分
6、析淘選出的肽段，模擬得到4個構(gòu)象表位C-AK-1（D3A4K43M1A5T49T44I7）、C-AK-2（L31K33V35T32E11E18F14S34D37）、C-AK-3（V177G172M173D176Q178T174L181K175L187）和C-AK-4（R202L170Y203E190P205W204L187T206Y145），以及關(guān)鍵氨基酸依次為D3，K33，T174和W204。根據(jù)噬菌體展示淘選結(jié)果設(shè)計合成了19個重疊肽段，利用甲殼類過敏患者血清檢測發(fā)現(xiàn)與血清IgG特異識別結(jié)合的7個肽段（AA：
7、113-127，127-141，134-148，141-155，204-218，211-225和316-330）和與血清IgE特異識別結(jié)合的6個肽段（AA：113-127，127-141，141-155，204-218，211-225和316-330）。進一步通過肥大細胞（RBL-2H3）脫顆粒實驗確定AK的4個線性表位：L-AK-1（AA：113-127），L-AK-2（AA：127-141），L-AK-3（AA：141-155）和L-AK-1（AA：204-218）。利用十二烷基磺酸鈉（SDS）、β-巰基乙醇
8、（β-Me）、二硫蘇糖醇（DTT）、尿素和鹽酸胍等變性劑處理天然AK，通過免疫印跡檢測變性處理后AK的IgE結(jié)合活性變化，結(jié)果表明AK的致敏性依賴于其空間構(gòu)象的完整性，存在于分子內(nèi)部的二硫鍵Cys201-Cys271對于維持AK的空間構(gòu)象具有關(guān)鍵作用，是影響AK致敏性的關(guān)鍵位點。綜上，本研究對擬穴青蟹AK的抗原表位進行了定位分析，確定了AK致敏性的關(guān)鍵I位點及其構(gòu)效關(guān)系，
