實驗糞便中球蟲卵囊的計數(shù)、分離和孢子化培養(yǎng)

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1、www.yiqibank.com實驗二、糞便中球蟲卵囊的計數(shù)、分離和孢子化培養(yǎng)技術（Counting,isolationandsporulationtechnologyforcoccidialoocystsinfeces）轉載自百度文庫：河南科技大學動物科技學院閆文朝博士文章麥氏蟲卵計數(shù)板產(chǎn)品鏈接：http://www.yiqibank.com/yiqibank_Product_22204949.html【目的要求】認識動物常見重要球蟲卵囊的形態(tài)特征；掌握糞便中球蟲卵囊的計數(shù)、分離和孢子化培養(yǎng)基本操作方法。這些操作是實驗室開展球蟲研

2、究最常用的實驗技術?！净驹怼柯涯彝ǔ４嬖谟谒拗骷S便中，從糞便中分離球蟲卵囊的方法有飽和食鹽溶液漂浮法、飽和蔗糖溶液漂浮法和飽和硫酸鎂溶液漂浮法，其中最常用的方法為飽和食鹽溶液漂浮法。其原理是懸浮溶液如飽和食鹽溶液密度高于卵囊密度，而低于糞便中大多數(shù)雜質，經(jīng)離心或靜置沉淀后，大部分雜質沉淀在容器底部，卵囊漂浮在懸浮溶液的表面，然后收集表層漂浮物；由于卵囊比重大于水的比重，所以表層漂浮物用自來水稀釋離心后，卵囊沉淀富集于離心管底部即可得到大量球蟲卵囊。計算球蟲感染強度即每克糞便中卵囊數(shù)量（oocystspergram,OPG）和保存

3、卵囊懸液中卵囊數(shù)量通常用麥克馬斯特法(McMaster’smethod)和血細胞計數(shù)板計數(shù)法，應用最廣泛的是麥克馬斯特法。麥克馬斯特計數(shù)法的原理是用飽和食鹽溶液作為懸浮溶液，把卵囊與比重較大雜質分開，使卵囊漂浮至計數(shù)室表層，與計數(shù)室上層刻度部分處在同一層面上（或同一視野內(nèi)）；計數(shù)板上每個計數(shù)室容積為1×1×0.15=0.15mL（如圖1示），鏡檢計數(shù)0.15mL計數(shù)室內(nèi)卵囊數(shù)量，最后根據(jù)糞便克數(shù)和懸液稀釋倍數(shù)計算OPG值或單位體積內(nèi)卵囊濃度。圖1麥克馬斯特計數(shù)板結構示意圖在適宜的溫度通常25-28℃，濕度和充足的氧氣條件下，球蟲卵囊

4、在體外進行減數(shù)分裂，一個卵囊內(nèi)形成4個孢子囊，每個孢子囊內(nèi)通過有絲分裂產(chǎn)生2個子孢子。由于糞便中大量的雜質影響氧氣擴散，雜菌生長消耗氧氣，使卵囊發(fā)育不良，因此孢子化培養(yǎng)最好在分離后進行。最好的培養(yǎng)液是2.5%重鉻酸鉀溶液，最適宜的培養(yǎng)溫度是28℃，培養(yǎng)過程中需要攪拌振蕩或吹氣以達到增氧目的。不同種類球蟲卵囊孢子化時間有差異，通常在48～72h。用次氯酸鈉處理孢子化卵囊除去污染的細菌和真菌，延長卵囊保存時間。【器材準備】www.yiqibank.com1、試劑材料：新鮮雞糞便，飽和食鹽溶液，2.5%重鉻酸鉀溶液。飽和食鹽溶液的配制：稱

5、取400g食鹽，放入三角燒瓶中，加入1000mL沸水，攪拌充分溶解后，靜置冷卻，有少量鹽析出，即為飽和鹽水，比重約為1.18。2.5%重鉻酸鉀溶液的配制：2.5g重鉻酸鉀固體加入100mL蒸餾水，攪拌完全溶解即可。2、儀器用具：低速離心機，托盤天平，顯微鏡，麥克馬斯特計數(shù)板，恒溫培養(yǎng)箱，空氣浴恒溫搖床，增氧泵，手動計數(shù)器，200mL錐形瓶，平皿，載玻片，蓋玻片，膠頭滴管?！緦嶒灢襟E】1、球蟲卵囊的形態(tài)學觀察認識和了解球蟲卵囊包括未孢子化和孢子化卵囊的一般形態(tài)結構特征，是進行動物球蟲卵囊的計數(shù)、收集分離和孢子化培養(yǎng)的前提。球蟲未孢子化

6、卵囊：不同種屬未孢子化卵囊共同特征是卵囊內(nèi)呈現(xiàn)一團原生質，包含核質、各種細胞器等結構。其他結構如卵囊形狀、大小以及卵囊壁結構與孢子化后相同（如圖2所示）。艾美耳屬孢子化卵囊：均有4個孢子囊，每個孢子囊內(nèi)包含2個子孢子。不同蟲種的卵囊形態(tài)、大小、有無卵膜孔、極粒、卵囊殘體和孢子囊殘體等特征存在差異。（如圖3所示）等孢屬孢子化卵囊：均有2個孢子囊，每個孢子囊內(nèi)包含4個子孢子。其他結構特征隨蟲種而存在差異（如圖4所示）。溫揚屬孢子化卵囊：均有4個孢子囊，每個孢子囊內(nèi)包含4個子孢子。其他結構特征隨蟲種而存在差異（如圖5所示）。泰澤屬孢子化卵

7、囊：卵囊內(nèi)存在8個子孢子和卵囊殘體，無孢子囊結構（如圖6所示）。圖2球蟲未孢子化卵囊結構示意圖圖3艾美耳屬球蟲孢子化卵囊結構示意圖1，極帽；2，卵膜孔；3，極粒；4，孢子囊；5，孢子囊殘體；6，卵囊殘體；7，子孢子www.yiqibank.com圖4等孢屬球蟲孢子化卵囊結構示意圖1，孢子囊；2，子孢子；3：孢子囊殘體圖5菲萊氏溫揚球蟲卵囊1.孢子囊；2.子孢子；3.殘體圖6　毀滅泰澤球蟲卵囊1，子孢子；2，殘體2、球蟲卵囊的計數(shù)2.1糞便中球蟲卵囊的計數(shù)—麥克馬斯特法取2g新鮮雞糞便置于干凈的100mL燒杯內(nèi)，先加入8mL飽和食鹽溶

8、液，用玻棒搗碎混勻，再加入50mL飽和食鹽溶液，混勻后立即用紗布或60目篩網(wǎng)過濾，然后立即吸取濾液充滿2個計數(shù)室，在顯微鏡載物臺上靜置3～5min，在10倍物鏡下鏡檢計數(shù)，每個計數(shù)室內(nèi)有100個方格，其體積為1cm×1cm×0.15c