（精）病毒感染力的滴定(tcid50的測定)

《（精）病毒感染力的滴定(tcid50的測定)》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。

1、病毒感染力的滴定（TCID50的測定）概念：半數(shù)感染量（medianinfectivedose，ID50）表示在規(guī)定時間內(nèi)，通過指定感染途徑，使一定體重或年齡的某種動物半數(shù)感染所需最小細(xì)菌數(shù)或毒素量。一、實驗?zāi)康牧私獠《靖腥玖y定的幾種常用方法，掌握半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)物感染量TCID50的操作步驟、計算方法及含義。二、測定病毒感染力的方法半數(shù)致死量LD50(50%lethaldose)：用動物或雞胚來檢測半數(shù)雞胚感染量EID50(egg50%infectivedose)：用雞胚來檢測半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)物感染量TCID50（50%tissuecultureinfec

2、tivedose)：用細(xì)胞來檢測蝕斑形成單位（plaqueformingunit，PFU）：用細(xì)胞來檢測三、材料1、長滿單層的細(xì)胞1瓶2、胰酶、吸球、吸管、生長液3、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板4、加樣器、槍頭5、病毒液（PRV）四、TCID50的操作步驟1、在青霉素瓶或離心管中將病毒液作連續(xù)10倍的稀釋，從10-1-10-10。2、將稀釋好的病毒接種到96孔微量培養(yǎng)板中，每一稀釋度接種一縱排共8孔，每孔接種100μl。3、在每孔加入細(xì)胞懸液100μl，使細(xì)胞量達(dá)到2~3×105個/ml。4、設(shè)正常細(xì)胞對照，正常細(xì)胞對照作兩縱排。（100μl生長液+100μl細(xì)胞

3、懸液）5、逐日觀察并記錄結(jié)果，一般需要觀察5-7天。6、結(jié)果的計算，按Reed-Muench兩氏法或Karber法五、TCID50的計算方法1、Reed-Muench兩氏法病毒液稀釋度出現(xiàn)CPE孔數(shù)無CPE孔數(shù)累計出現(xiàn)CPE孔所占的%CPE孔數(shù)無CPE孔數(shù)10-180270100（27/27）10-280190100（19/19）10-37111191.6（11/12）10-4354640（4/10）10-5171130.7（1/14）10-6080210（0/21）CPE：Cytopathiceffect距離比例＝（高于50%病變率的百分?jǐn)?shù)-50%）

4、/（高于50%病變率的百分?jǐn)?shù)-低于50%病變率的百分?jǐn)?shù)）＝（91.6-50）/（91.6-40）＝0.8lgTCID50=距離比例×稀釋度對數(shù)之間的差+高于50%病變率的稀釋度的對數(shù)=0.8×(-1)+(-3)=-3.8TCID50=10-3.8/0.1ml含義：將該病毒稀釋103.8接種100μl可使50%的細(xì)胞發(fā)生病變。2、Karber法病毒液稀釋度出現(xiàn)CPE的孔數(shù)出現(xiàn)CPE孔的比率10-188/8=110-288/8=110-377/8=0.87510-433/8=0.37510-511/8=0.12510-600/8=0lgTCID50=L-d

5、(s-0.5)L：最高稀釋度的對數(shù)D：稀釋度對數(shù)之間的差S：陽性孔比率總和lgTCID50=-1-1×(3.375-0.5)=-3.875TCID50=10-3.875/0.1ml含義：將該病毒稀釋103.875接種100μl可使50%的細(xì)胞發(fā)生病變。實例1雞新城疫活疫苗（一）培養(yǎng)病毒?將雞新城疫病毒（lasota株）接種于9～11d雞胚的尿囊腔中，接種后48～72h收獲病毒，供檢測與制苗用。（二）檢測尿囊液病毒的EID501．EID50的概念?EID50為半數(shù)雞胚感染量，是利用不同稀釋度的病毒液接種雞胚后，能使半數(shù)雞胚發(fā)生感染的病毒量。2．病毒EID

6、50的測定（1）稀釋病毒?將收獲的尿囊液充分混勻后取1ml，作10倍遞進(jìn)稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7…稀釋度。（2）接種雞胚?每個稀釋度接種9～11dSPF雞胚5枚，接種量為0.1ml/枚，37℃溫箱培養(yǎng)，逐日觀察至120h，其間死亡的雞胚及時拿出冷藏，至第5d時將所有的雞胚置4℃冰箱中冷卻4h或過夜，收獲每枚雞胚的尿囊液，分別存放。（3）檢測血凝價，判斷感染情況?用微量血凝試驗逐枚檢測雞胚尿囊液中病毒的血凝價，當(dāng)HA≥1:128時判為感染。3．根據(jù)血凝價計算EID50：EID50計算舉例(1)EID50測

7、定結(jié)果見表EID50測定結(jié)果?????????????????(接種劑量0.1ml)病毒稀釋度觀察結(jié)果累計結(jié)果感染數(shù)???????無感染數(shù)???????感染%感染數(shù)????無感染數(shù)????感染%10-5????????5????????????0???????????100??????10??????????0?????????10010-6??????????3????????????2????????????60???????5??????????2??????????7110-7?????????2????????????3???????????

8、?40????????2??????????5??????????2910-8????????