hplc改善峰形方案設(shè)計(jì)

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1、實(shí)用標(biāo)準(zhǔn)文案三、峰形問題??峰形對(duì)稱性的優(yōu)劣對(duì)峰面積和分離度有很大的影響，從而影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。引起峰形異常的因素很多，柱外死體積引起峰形異常有個(gè)特點(diǎn)：對(duì)先出的峰影響大，對(duì)后出峰影響?。恢^塌陷、柱頭和篩板污染會(huì)引起所有的峰形都異常，而硅醇基次級(jí)保留只引起部分峰拖尾。相塌陷除了引起保留下降外，也會(huì)造成峰拖尾。色譜實(shí)踐中，大部分的峰形問題都不是色譜柱的問題，儀器參數(shù)設(shè)定、色譜條件和方法正確與否對(duì)峰形有很大影響。1.??峰后拖常見的3種拖尾情況：次級(jí)保留引起峰拖尾的機(jī)理解析：反相色譜中，通常非極性

2、和弱極性的化合物能獲得良好的峰形，而帶有－COOH、－NH2、－NHR、－NR2等極性基團(tuán)的化合物則比較容易產(chǎn)生拖尾，原因是硅膠表面殘留硅羥基對(duì)極性和堿性樣品分子產(chǎn)生次級(jí)保留效應(yīng)。文檔實(shí)用標(biāo)準(zhǔn)文案??反相填料表面有殘余的硅羥基，具有一定的酸性，其pKa約為4.5～4.7。根據(jù)電離規(guī)律，流動(dòng)相的pH－pKa>2即pH>6.7時(shí)，99％以上的硅羥基應(yīng)該是呈離子狀態(tài)的，即Si－O－，而pKa－pH>2即pH<2.5時(shí)，酸性環(huán)境抑制了硅羥基的電離，99％以上的硅羥基應(yīng)該是呈分子狀態(tài)的，即Si－OH，但其極

3、性仍然存在，即Si－Oδ－Hδ＋。Si－Oδ－Hδ＋和－Si－O－對(duì)于極性化合物之間的作用力則是一種極性的靜電作用力，這種作用力比范德華力要強(qiáng)得多。同時(shí)，因?yàn)楣枘z表面鍵合了C18長(zhǎng)鏈，由于空間位阻作用，樣品分子中能接觸到殘余硅羥基的機(jī)會(huì)不多，只有少部分的分子才能與殘余硅羥基產(chǎn)生強(qiáng)的靜電作用而被推遲洗脫出來，產(chǎn)生后拖。拖尾嚴(yán)重的程度與樣品分子極性大小和殘余硅羥基的多少有著直接的關(guān)系。??上圖是填料表面的示意圖，完全硅羥化的硅膠表面硅羥基濃度為8?mol/m2，由于空間位阻的作用，通常與C18硅烷基發(fā)

4、生反應(yīng)的僅達(dá)2～3.5?mol/m2，需要再用小分子的硅烷跟硅羥基反應(yīng)，如圖中的三甲基氯硅烷，使硅羥基中的氫變成了三甲基硅烷的一個(gè)惰性基團(tuán)。三甲基硅烷還是比氫原子大得多，還是不能將所有的殘余硅羥基的活性封閉掉。??文檔實(shí)用標(biāo)準(zhǔn)文案相同的樣品在不同品牌的柱子上產(chǎn)生拖尾的嚴(yán)重性不同，從填料合成的角度而言就是鍵合密度是否高、封尾是否徹底，高密鍵合和徹底的封尾能顯著減少這種機(jī)會(huì)，獲得良好的峰形。Welch公司Ulimate品牌的XB－C18、AQ－C18和XtimateC18采取的就是高密鍵合和徹底的雙峰

5、尾工藝。解決方案：1）先檢查樣品是否過載，由于樣品過載引起的峰形后拖不能通過改變色譜條件消除。如果發(fā)現(xiàn)過載，需降低進(jìn)樣量（包括進(jìn)樣體積或濃度），進(jìn)樣量越小，峰形越好，例子如頭孢尼西鈉的測(cè)定：2）調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH將流動(dòng)相的pH調(diào)至比弱酸pKa小2以上，比弱堿pKa大2以上，可有效抑制易離子化待測(cè)物的電離，從而取得良好峰形。例子如二甲基苯氧乙酸的測(cè)定：??堿性化合物中，甲胺的pKa為10.64，那么在pH<8.64的時(shí)候它是完全呈離子態(tài)的，文檔實(shí)用標(biāo)準(zhǔn)文案那么pH在2.5~8.64時(shí)，特別是pH6.7～

6、8.64時(shí)，此時(shí)甲胺和硅羥基均以離子狀態(tài)－NH3＋和Si－O－形式存在的，它們之間相互吸引的靜電作用導(dǎo)致后拖，這就是為什么很多堿性化合物在pH7.0的條件下容易產(chǎn)生拖尾的原因。而很多色譜柱生產(chǎn)商也因此以阿米替林（含－N(CH3)2，堿性比－NH2強(qiáng)）在pH7.0的條件下來評(píng)價(jià)和比較不同色譜柱之間的優(yōu)劣，該條件下的阿米替林的峰形越好說明封尾越好。而在pH<2.5的條件下，也仍然后拖，是因?yàn)椋璑H3＋足夠強(qiáng)，即使硅羥基以分子狀態(tài)存在也仍能夠與Si－Oδ－Hδ＋中氧原子產(chǎn)生吸引作用，導(dǎo)致峰形拖尾。當(dāng)pH

7、>12.64，大于pKa2以上時(shí)，甲胺完全以分子狀態(tài)形式存在，不會(huì)引起拖尾。3）增加緩沖鹽或增大緩沖鹽的濃度：??流動(dòng)相中加入緩沖鹽，增強(qiáng)了流動(dòng)相的離子強(qiáng)度，在－NH3＋等極性基團(tuán)和硅羥基Si－O－之間存在著許多離子的干擾，減少了樣品分子與硅羥基之間相互接觸的機(jī)會(huì)，有助于削弱極性基團(tuán)與硅羥基之間的相互作用，改善峰形。這種適合于堿性較弱（如氨基的N原子與強(qiáng)吸電子基相連），或堿性很強(qiáng)，但在剛性結(jié)構(gòu)中，比較難以接近被C18長(zhǎng)鏈和封尾試劑覆蓋的硅羥基，例子如高烏甲素的測(cè)定：文檔實(shí)用標(biāo)準(zhǔn)文案4）加入三乙胺、

8、四丁基硫酸氫銨或辛烷磺酸鈉等??拖尾的產(chǎn)生是因?yàn)椋璑H2、－NHR、－NR2與硅羥基發(fā)生靜電作用引起的，那么阻礙它們之間靜電作用的途徑，應(yīng)該有兩種，一種是占據(jù)硅羥基這個(gè)作用位點(diǎn)，另一種是占據(jù)－NH2、－NHR、－NR2這個(gè)作用位點(diǎn)。???在流動(dòng)相中加入三乙胺，能顯著的改善峰形，消除拖尾，其作用是屏蔽硅羥基。三乙胺的pKa為11.09，在pH<11.09－2＝9.09的條件下是以離子狀態(tài)N＋H(CH2CH3)3的形式存在的，因此pH在2.5~8.64硅羥基呈Si－O－離子態(tài)的情況下，