HPLC改善峰形方案

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1、三.峰形問題峰形對稱性的優(yōu)劣對峰面積和分離度有很大的影響，從而影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。引起峰形異常的因素很多，柱外死體積引起峰形異常有個特點：對先出的峰影響大，對后出峰影響?。恢^塌陷、柱頭和篩板污染會引起所有的峰形都異常，而硅醇基次級保留只引起部分峰拖尾。相塌陷除了引起保留下降外，也會造成峰拖尾。色譜實踐中，大部分的峰形問題都不是色譜柱的問題，儀器參數(shù)設(shè)定、色譜條件和方法正確與否對峰形有很大影響。1?峰后拖常見的3種拖尾情況：■好.育■MH*)WSMS“IMFMM*MBSt評suoovntuwoooi99mooviwi?二甲基玉暫乙酸的測定Tf=1.992地紅奇

2、索的測定Tf=1.268-3M-wtiff?tBMtIM■MB1*頭抱地棗訥的測定Tf=3.109^'次級保留引起峰拖尾的機理解析：反相色譜中，通常非極性和弱極性的化合物能獲得良好的峰形,而帶有一COOH、—NH2、一NHR、-NR2等極性基團的化合物則比較容易產(chǎn)生拖尾，原因是硅膠表面殘留硅梵基對極性和堿性樣品分了產(chǎn)牛次級保留效應(yīng)。反相填料表而有殘余的硅徑基，具有一定的酸性，其pKa約為4.5?4.7。根據(jù)電離規(guī)律，流動相的pH-pKa>2即pH>6.7時，99%以上的硅徑基應(yīng)該是呈離子狀態(tài)的，即Si-O-,而pKa-pH>2即pH<2.5時，酸性環(huán)境抑制了硅超

3、基的電離，99%以上的硅超基應(yīng)該是呈分子狀態(tài)的，即Si-OH,但其極性仍然存在，即Si-06-H5+oSi-O6-H6+和一Si—0—對于極性化合物Z間的作用力則是一種極性的靜電作用力，這種作用力比范德華力要強得多。同時，因為硅膠表面鍵合了C18長鏈，由于空間位阻作用，樣品分子屮能接觸到殘余硅輕基的機會不多，只有少部分的分子才能與殘余硅輕基產(chǎn)生強的靜電作用而被推遲洗脫出來，產(chǎn)生后拖。拖尾嚴(yán)重的程度與樣品分子極性大小和殘余硅輕基的多少有著直接的關(guān)系。ch3OH■OrSiRch3CHSOHE"ohch3+ClSiR+1JaeClSiCH3OHch3CH,OHH]d!

4、strR■C8wC1Betc(TMS)CH3上圖是填料農(nóng)面的示意圖，完全硅疑化的硅膠農(nóng)面硅疑基濃度為8?mol/m2,由丁?空間位阻的作用，通常與C18硅烷基發(fā)生反應(yīng)的僅達2?3.5?mol/m2,需耍再用小分子的硅烷跟硅疑基反應(yīng)，如圖中的三甲基氯硅烷，使硅疑基中的氫變成了三甲基硅烷的一個惰性基團。三甲基硅烷還是比氫原子大得多，還是不能將所有的殘余硅疑基的活性封閉掉。相同的樣品在不同品牌的柱子上產(chǎn)生拖尾的嚴(yán)重性不同，從填料合成的角度而言就是鍵合密度是否高、封尾是否徹底，高密鍵合和徹底的封尾能顯著減少這種機會，獲得良好的峰形。Welch公司Ulimate品牌的XB

5、-C1&AQ—C18和XtimateC18采取的就是高密鍵合和徹底的雙峰尾工藝。解決方案:1）先檢查樣品是否過載,由于樣品過載引起的峰形后拖不能通過改變色譜條件消除。如果發(fā)現(xiàn)過載，需降低進樣量（包括進樣體積或濃度），進樣量越小，峰形越好，例子如頭抱尼西鈉的測定:頭ffi尼西鈉的測定50n^/100ml用疣動相濬解樣品Tf=2.248頭抱尼西鈉的測定0.5mg/100ml^用流動相落解樣品Tf=1.068?15LMS?rLV??MBSa?E3?5.71Hft.225?m00002.M—f各“審曲E】—JUT11D

6、

7、?KH

8、DM2）調(diào)節(jié)流動相pH將流動相的pH調(diào)至

9、比弱酸pKa小2以上，比弱堿pKa大2以上，可有效抑制易離子化待測物的電離，從而取得良好峰形。例子如二甲基苯氧乙酸的測定：堿性化合物中，甲胺的pKa為10.64,那么在pH<8.64的時候它是完全呈離了態(tài)的，那么pH在2.5?8.64時，特別是pH6.7?8.64時，此時甲胺和硅輕基均以離子狀態(tài)一NH3+和Si—0—形式存在的，它們之間相互吸引的靜電作用導(dǎo)致后拖，這就是為什么很多堿性化合物在pH7.0的條件下容易產(chǎn)生拖尾的原因。而很多色譜柱生產(chǎn)商也因此以阿米替林（含一N（CH3）2,堿性比一NH2強）在pH7.0的條件下來評價和比較不同色譜柱Z間的優(yōu)劣，該條件下

10、的阿米替林的峰形越好說明封尾越好。而在pH<2.5的條件下，也仍然后拖，是因為一NH3+足夠強，即使硅超基以分子狀態(tài)存在也仍能夠與SI-O6-H6+中氧原子產(chǎn)生吸引作用，導(dǎo)致峰形拖尾。當(dāng)pH>12.64,大于pKa2以上時，甲胺完全以分子狀態(tài)形式存在，不會引起拖尾。3）增加緩沖鹽或增大緩沖鹽的濃度:流動相小加入緩沖鹽，增強了流動相的離子強度，在一NH3+等極性基團和硅疑基Si-O-Z間存在著許多離子的干擾，減少了樣品分子與硅疑基Z間相互接觸的機會，有助于削弱極性基團與硅輕基Z間的相互作用，改善峰形。這種適合于堿性較弱（如氨基的N原子與強吸電子基相連），或堿性很強

11、，但在剛性結(jié)構(gòu)屮，比較難