.脫氫酶活性測定

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1、實驗（七）脫氫酶活性測定脫氫酶的正式命名應(yīng)是AH：B氧化還原酶，它能酶促自一定的基質(zhì)中脫出氫而進行氧化作用。脫氫酶廣泛存在動植物組織和微生物細胞內(nèi)。脫氫酶的種類因電子供給體和接受體的特異性而有不同。單位時間內(nèi)脫氫酶活化氫的能力表現(xiàn)為它的酶活性。通過測定活性污泥或土壤中微生物的脫氫酶活性，可以了解微生物對污泥或土壤中有機物氧化分解能力，即污泥酶或土壤酶的活性。利用已知受氫體能接受脫氫酶脫出的氫原子，如無色的氯化三苯基四氮唑（TTC，2，3，5-triphenyltetrazoliumchloride）,俗稱紅四唑，接受氫后變成紅色的三苯基甲臜（TF，triphenylf

2、ormazan）,根據(jù)產(chǎn)生紅色的色度進行比色定量分析，以判斷脫氫酶活性。TTC作為受氫體，其還原過程可用下式表示。HHN-N-C6H5N-N-C6H5C6H5-+2e-C6H5-+HCL++2H+N=N-C6H5N=N-C6H5CI(無色TTC)(紅色TF)根據(jù)紅色的深淺，測出相應(yīng)的吸光值（A值），求出脫氫酶的活性。通常A值越大（紅色深），脫氫酶活性越高。1．1材料與方法(1)材料活性污泥懸浮液或土壤懸浮液。(2)方法分光度法。要點①所有操作應(yīng)當盡量在避光條件下進行。脫氫酶最適反應(yīng)條件，溫度30～37℃,PH值7.4～8.5。②取用甲醛時要小心，不要碰到皮膚上，如若沾

3、到皮膚上要迅速用自來水沖洗。2．2實驗步驟（1）繪制TTC標準曲線①配制系列濃度的TTC標準溶液。先取5支50mL帶塞比色管，按順序盡快分別加入0.36％Na2So3溶液2.5ml，Tris-HCl緩沖液（pH值7.6）7.5mL在分別吸取0.4％TTC溶液0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL,放入5支比色管中，用蒸餾水定容至50mL,使成8μg·mL-1、32μg·mL-1、40μg·mL-1系列濃度。同時另取一支50mL比色管，加入0.36％Na2SO3溶液2.5mL,Tris-HCl緩沖溶液（pH值7.6）7.5mL,加入蒸餾水至50mL,

4、作為空白對照。②向每支比色管中各加入少許（十幾粒）連二亞硫酸鈉（Na2SO4）混勻，使TTC全部還原成紅色的TF(三苯基甲臜)。③向各管滴加5mL甲醛終止反應(yīng)，搖勻后加入5mL丙酮振蕩搖勻，37℃水浴10分鐘。④在485㎜波長下測定吸光值A(chǔ)。⑤以A值為縱坐標，TTC濃度為橫坐標，繪制出TTC標準曲線。（2）活性污泥脫氫酶活性的測定(略)①活性污泥懸浮液的制備取50mL活性污泥液（約1.5～3g·L-1）放入三角瓶中，加入數(shù)粒玻璃珠劇烈搖動將污泥打碎。40000r.min-1離心5min,棄去上清液，再用生理鹽水補充水分，懸浮，洗滌，離心，反復(fù)三次。最后用生理鹽水補至原

5、體積。②取4個40mL據(jù)塞離心管(1個對照，3個平行)，分別加入Na2SO3溶液0.5ml，Tris-HCL緩沖液（PH值7.6）2.0ML，污泥懸浮液2mL，0.4％TTC液0.5mL(對照管不加TTC液，以0.5mL蒸餾水取代），使最終體積都為5mL,蓋緊塞子。③將離心管搖勻，立即放入37℃水浴中培養(yǎng)10分鐘（以顯色為準）。④各管分別加入0.5mL甲醛終止反應(yīng)。再向各管分別加入5mL丙酮振搖數(shù)十次，37℃水浴保溫10分鐘。⑤4000r.Min-1離心5分鐘，取上清液在485nm波長下測定A值并在標準曲線上查出相應(yīng)得TTC濃度。（3）土壤脫氫酶活性的測定①取3個50

6、mL具塞比色管，分別稱取通過2mm篩的土樣5g，加入比色管中，再加入5mL0.4％TTC液，另取一個50mL具塞比色管加入同種土樣的滅菌土5g，也加入5mL0.4％TTC液，作為對照。②將以上4個具塞比色管避光，37℃水域鍋中保溫培養(yǎng)12～24h。③培養(yǎng)結(jié)束后，加入5mL甲醛終止反應(yīng)，再分別加入5mL丙酮振蕩并在37℃保溫10分鐘，轉(zhuǎn)入離心管。④4000r.min-1離心5分鐘，取上清液在485nm波長下測定A值，在標準曲線上查出相應(yīng)的TTC濃度。3．3結(jié)果與討論（1）脫氫酶活性的計算脫氫酶活性=ABC（6-5）式中，A為由標準曲線上查出的TTC濃度，(μg.mL-1

7、);B為培養(yǎng)時間校正值（h）;C為比色時稀釋倍數(shù)，當A值大于0.8時，要適當稀釋，使A值在0.8以下。（2）影響脫氫酶活性的因素有哪些？（3）已知乳酸脫氫酶（LDH）在DAD+的遞氫作用下，是乳酸脫氫生成別丙酮酸。丙酮酸在堿性溶液中與2，4-二硝基苯肼生成2，4-二硝基苯腙使溶液呈棕色。顏色的深淺與丙酮酸濃度成正比。請設(shè)計一個測定動物肝臟乳酸脫氫酶活性的實驗。要點丙酮酸標準溶液配制——稱取丙酮酸鈉11mg，用0.05mol.L-1硫酸溶解后，定容至100mL，置冰箱中保存?？傸S酮生物總黃酮是指黃酮類化合物，是一大類天然產(chǎn)物，廣泛存在于植物界，是許多中