授粉后黃瓜果實(shí)膨大生長(zhǎng)相關(guān)基因的克隆與表達(dá)分析

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1、Y937851單位代碼10635學(xué)號(hào)2003016西弗．蟲學(xué)博士學(xué)位論文授粉后黃瓜果實(shí)膨大生長(zhǎng)相關(guān)基因的克隆與表達(dá)分析論文作者：孫涌棟指導(dǎo)教師：張興國(guó)研究員學(xué)科專業(yè)：蔬菜學(xué)研究方向：分子生物學(xué)與分子育種提交論文日期：2006年5月10曰論文答辯日期：2006年6月日學(xué)位授予單位：西南大學(xué)中國(guó)·重慶2006年5月西南大學(xué)博士學(xué)位論文量■■量皇置量●皇皇皇■皇奠■墨—■■————————■皇鼉—■_iI—曹曼旨—薯葛啊_——■■■E量酋■對(duì)非單性結(jié)實(shí)的全雌黃瓜材料人工授粉。并對(duì)授粉后0～6d的果實(shí)早

2、期發(fā)育過程進(jìn)行了觀察。從授粉后第2d開始，幼果生長(zhǎng)加快，明顯伸長(zhǎng)。在授粉后3d到授粉后6d的這段時(shí)間里，幼果進(jìn)入迅速生長(zhǎng)狀態(tài)。因此我們推測(cè)，授粉后0～2d是啟動(dòng)果實(shí)膨大生長(zhǎng)的關(guān)鍵時(shí)期。利用cDNA—AFLP技術(shù)顯示開花后未經(jīng)授粉0h黃瓜子房和授粉后0～3d這段時(shí)間的黃瓜幼果的基因表達(dá)差異，便可能弄清楚哪些基因啟動(dòng)或參與了黃瓜幼果早期發(fā)育過程和起著關(guān)鍵作用。2利用cDNA-AFLP技術(shù)分析授粉前后黃瓜幼果的基因表達(dá)差異取開花當(dāng)天未經(jīng)授粉0h子房作為授粉前的幼果樣品；取授粉后6h、12h、24h、3

3、6h、48h、72h幼果，并在RNA提取時(shí)等量混合后作為授粉后的幼果樣品。用上海生工的UNIQ—10柱式TRIZOL總RNA抽提試劑盒分別提取授粉前和授粉后幼果樣品的總RNA，兩個(gè)幼果樣品總RNA的0D2。o／ODm值都在1．6～l-7之間；瓊脂糖電泳結(jié)果顯示，28SrRNA亮于18SrRNA。且條帶清晰；用PolyATtract’mRNAIsolation：SystemⅢ(Pmomega,USA)磁珠法純他PolyA+RNA。兩個(gè)幼果樣品mRNA的嘶∥O現(xiàn)*值都在2．2～2．5之間。從電泳圖譜

4、可以看出，mRNA從300bp至2kb以上的范圍呈彌散分布，表明mRNA比較完接，基本沒有被#肇解。符合進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的需要。采用刪LV第一鏈cDNA合成試劑盒(Sangon。Shanghai)合成單鏈eDNA(sscDNA)，sscDNA主要分布在500bp以上，呈彌散分布。￡coliDNA聚合酶I和置換法合成cDNA第二鏈(dscDNA)。然后參照Bachem(1996)cDNAIAFLP技術(shù)和CLONTECH公司的AFLP分析系統(tǒng)Ⅱ試劑盒的方法進(jìn)行AseI／TaqI酶切、連接頭和PCR擴(kuò)增。6

5、％的測(cè)序膠電泳分離PCR產(chǎn)物。按Promega公司的銀染試劑盒說明書進(jìn)行銀染顯示，x光膠片觀察燈下數(shù)碼成像和統(tǒng)計(jì)結(jié)果，分析樣品間的cDNA-AFLP差異。PCR選擴(kuò)產(chǎn)物經(jīng)6％的濺序膠電泳分離后平均每條泳道有大于100hp的譜帶30～40條，轉(zhuǎn)錄本差示帶主要位于100～300bp之聞。64對(duì)引物組合中有54．7％的引物對(duì)擴(kuò)增后呈現(xiàn)多態(tài)性，一般能顯出l～2條cDNA差示帶。開花后授粉與不授粉的黃瓜幼果組織之間存在明顯的基因表達(dá)差異，表明部分在子房發(fā)育時(shí)期表達(dá)的基因在授粉后子房或幼果膨大生長(zhǎng)期被關(guān)閉，

6、而授粉后出現(xiàn)了新的轉(zhuǎn)錄本。共獲得64條僅在授粉后出現(xiàn)的cDNA-AFLP差示片段。3反向Northern斑點(diǎn)雜交分析同收授粉后幼果樣品中特異顯示的cDNA-AFLP凝膠帶，PCR擴(kuò)增、UNIQ-10柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化后點(diǎn)膜，分別以開花當(dāng)天未經(jīng)授粉0h予房和授粉后6～72h幼果兩個(gè)樣品的sscDNA為探針，使用地高辛(DIG)核酸標(biāo)記和檢測(cè)試劑盒(Roche，Germany)進(jìn)行探針標(biāo)記、反向Northern斑點(diǎn)雜交和檢測(cè)。64條cDNA-AFLP著示片段中有5條片段與授粉后幼果樣晶的c

7、DNA探針有較強(qiáng)的雜交信號(hào)，而與授粉前幼果樣鼎的cDNA探針有微弱的雜交信號(hào)或無(wú)雜窆信號(hào)；9條片段與兩種探針均無(wú)雜交信號(hào)；其余50條片段與兩種探針均有較強(qiáng)的雜交摘要信號(hào)。因此認(rèn)為，經(jīng)斑點(diǎn)雜交驗(yàn)證確定的、在授粉后幼果組織中顯示的5條差示cDNA片段可能屬于授粉后黃瓜果實(shí)膨大生長(zhǎng)相關(guān)基因。4差示片段的克隆與序列分析將經(jīng)反向Northern斑點(diǎn)雜交驗(yàn)證為陽(yáng)性的cDNA—AFLP差示片段用冊(cè)高保真DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增、TaqDNA聚合酶加“A’，尾后，克隆到pMDl8-T載體上。轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株X

8、Ll-Blue感受態(tài)細(xì)胞。委托公司測(cè)序。通過互聯(lián)網(wǎng)在基因庫(kù)中搜尋同源序列，初步確認(rèn)所代表的基因，對(duì)新基因在GenBank上注冊(cè)。其中有3條cDNA片段(C0434606、C0434607和C0434609)在基因庫(kù)中未找到相似序列，可能屬于新的未知基因；1條cDNA片段(C0434608)的編碼序列與Mesembryanthemumcrystallinum和豌豆的谷胱甘肽還原酶基因有很高的同源性，是否暗示授粉后的黃瓜果實(shí)早期發(fā)育需要一個(gè)高度還原的胞內(nèi)環(huán)境，值得進(jìn)一步探明；1條cDNA片段(C04