小動(dòng)物活體成像的影響因素

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1、小動(dòng)物活體成像的影響因素自美國(guó)哈佛大學(xué)Weissleder等人提出了分子影像學(xué)（molecularimaging）的概念之后，近年來(lái)使用小動(dòng)物活體成像技術(shù)從事科學(xué)研究的科研工作者驟增。分子影像學(xué)是指應(yīng)用影像學(xué)方法，對(duì)活體狀態(tài)下的生物過程進(jìn)行細(xì)胞和分子水平的定性和定量研究。小動(dòng)物活體成像技術(shù)作為分子影像學(xué)的重要組成部分，主要通過生物發(fā)光（bioluminescence）與熒光（fluorescence）兩種技術(shù)來(lái)進(jìn)行。生物發(fā)光是用熒光素酶(Luciferase)基因標(biāo)記細(xì)胞或DNA，而熒光技術(shù)則采用熒光報(bào)告基團(tuán)（GFP、RFP,Cyt及dyes等）進(jìn)行標(biāo)記。越來(lái)越多的科研人員

2、希望能通過該技術(shù)來(lái)長(zhǎng)時(shí)間追蹤觀察活體動(dòng)物體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)以及對(duì)藥物治療的反應(yīng)，希望能觀察到熒光標(biāo)記的多肽、抗體、小分子藥物在體內(nèi)的分布和代謝情況。與傳統(tǒng)的體外成像或細(xì)胞培養(yǎng)相比，分子映像學(xué)具有著顯著優(yōu)點(diǎn)。首先，能夠反映細(xì)胞或基因表達(dá)的空間和時(shí)間分布，第二，可以對(duì)同一個(gè)研究個(gè)體進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間反復(fù)跟蹤成像，提高了數(shù)據(jù)的可比性，又不需要?dú)⑺滥Ｊ絼?dòng)物。第三，在藥物開發(fā)方面，為解決臨床藥物的安全問題提供了廣闊的空間，使藥物在臨床前研究中通過利用分子成像的方法，獲得更詳細(xì)的分子或基因水平的數(shù)據(jù)，為新藥研究的模式帶來(lái)了革命性的變革。獲得高質(zhì)量高清晰度的生物發(fā)光及熒光成像的圖片，對(duì)于進(jìn)一步的

3、實(shí)驗(yàn)分析和實(shí)驗(yàn)方案調(diào)整具有重要意義。那么影響成像效果的因素有哪些呢？應(yīng)該注意哪些問題才能達(dá)到較好的成像效果呢？一、CCD的性能1、CCD的尺寸和像素的大小直接影響CCD成像的能力大像素點(diǎn)能夠增加靈敏度，像素面積越大，對(duì)光越靈敏，因?yàn)橄袼攸c(diǎn)面積有更多電子，能產(chǎn)生更多信號(hào)。越高bin值像素點(diǎn)得面積越大，所能獲取的信號(hào)也越多，能夠拍攝到微弱的發(fā)光點(diǎn)。但由于像素點(diǎn)增大，會(huì)降低分辨率，導(dǎo)致圖像的清晰度變差。反過來(lái)說小的像素點(diǎn)能夠提高分辨率，但是像素點(diǎn)面積越小，其感光性越差，信噪比越低，動(dòng)態(tài)范圍越低。因此，想要獲得好的成像效果就要在大的像素點(diǎn)和小的像素點(diǎn)之間取得平衡。廣州中科愷盛醫(yī)療科

4、技有限公司的小動(dòng)物活體成像設(shè)備能夠很好地解決這個(gè)問題，他們?cè)O(shè)有3種不同的bin模式，1*1,2*2,4*4，可以滿足不同實(shí)驗(yàn)需求。2、動(dòng)態(tài)范圍的變化以bit值來(lái)表現(xiàn)，用來(lái)描述生成的圖像所能包含的顏色數(shù)，即灰階。16深度是16位意味著圖像含有2種顏色深度的變化，這樣級(jí)別的CCD才能準(zhǔn)確表現(xiàn)所檢測(cè)到的熒光信號(hào)的微小差異，進(jìn)而在圖像上表現(xiàn)出不同的深淺或色彩差異。3、對(duì)于同樣級(jí)別的CCD芯片來(lái)講，信噪比的高低則對(duì)最后的成像質(zhì)量更為關(guān)鍵，因?yàn)樾旁氡炔粌H與CCD本身有關(guān)，更與系統(tǒng)的整體配置和環(huán)境密切相關(guān)。信噪比（SNR）的計(jì)算方法如下：從公式可以看到，QE值，讀出噪聲和暗噪聲是影響SN

5、R的主要因素。溫度與暗電流有密切的關(guān)系。一般情況下，溫度越低，因溫度產(chǎn)生的暗噪聲也就越低；但是，當(dāng)溫度降低到一定程度時(shí)，亂真電荷（spuriouscharge）就會(huì)出現(xiàn)，從而增加了暗電流的值。因此，溫度對(duì)于CCD來(lái)講，并不是越低越好，而是有一個(gè)最佳值，即：既降低了溫度帶來(lái)的噪聲，又沒有引起亂真電荷的增加。廣州中科愷盛的可見光設(shè)備采用的CCD鏡頭在-70℃就能達(dá)到很好的去暗電流效果，而這個(gè)溫度又不足以引起亂真電荷的出現(xiàn)，因此能夠達(dá)到很高的性噪比。中科愷盛所采用的CCD鏡頭在500-700nm處能達(dá)到高達(dá)95%的量子效率，而這個(gè)波長(zhǎng)范圍基本上能夠滿足大多數(shù)實(shí)驗(yàn)工作者的需求。二：

6、實(shí)驗(yàn)所采用的細(xì)胞和基因的表達(dá)情況對(duì)于活體成像實(shí)驗(yàn)來(lái)講，實(shí)驗(yàn)涉及到利用活細(xì)胞系來(lái)進(jìn)行研究，不同的細(xì)胞系，表達(dá)蛋白的能力也不同，因此實(shí)驗(yàn)采用的細(xì)胞系的好壞，很大程度上影響了熒光成像的結(jié)果。重組基因或融合蛋白的表達(dá)情況同樣直接影響熒光的強(qiáng)弱，這個(gè)過程主要是由啟動(dòng)子的強(qiáng)弱來(lái)控制的。如果實(shí)驗(yàn)中采用了弱啟動(dòng)子，那么在熒光檢測(cè)時(shí)，很可能會(huì)導(dǎo)致熒光弱很多倍，這樣可能會(huì)導(dǎo)致有表達(dá)但是無(wú)法檢測(cè)到。因此，在啟動(dòng)子的選擇上最好選擇強(qiáng)啟動(dòng)子。三：熒光標(biāo)記的選擇活體熒光成像技術(shù)主要有三種標(biāo)記方法：熒光蛋白標(biāo)記、熒光染料標(biāo)記和量子點(diǎn)標(biāo)記。熒光蛋白適用于標(biāo)記腫瘤細(xì)胞、病毒、基因等。通常使用的是GFP、EG

7、FP、RFP（DsRed）等。熒光染料標(biāo)記和體外標(biāo)記方法相同，常用的有Cy3、Cy5、Cy5.5及Cy7，可以標(biāo)記抗體、多肽、小分子藥物等。量子點(diǎn)標(biāo)記作為一種新的標(biāo)記方法，是有機(jī)熒光染料的發(fā)射光強(qiáng)的20倍，穩(wěn)定性強(qiáng)100倍以上，具有熒光發(fā)光光譜較窄、量子產(chǎn)率高、不易漂白、激發(fā)光譜寬、顏色可調(diào)，并且光化學(xué)穩(wěn)定性高，不易分解等諸多優(yōu)點(diǎn)。量子點(diǎn)是一種能發(fā)射熒光的半導(dǎo)體納米微晶體，尺寸在100nm以下，它可以經(jīng)受反復(fù)多次激發(fā)，而不像有機(jī)熒光染料那樣容易發(fā)生熒光淬滅。但是不同熒光波長(zhǎng)的組織穿透力不同，如圖1所示，各種波長(zhǎng)的光