犬瘟熱病毒ELISA和RTPCR檢測方法的研究

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1、上海交通大學(xué)碩士學(xué)位論文犬瘟熱病毒ELISA和RT-PCR檢測方法的研究姓名：許莎瓊申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師：朱建國20060101上海交通大學(xué)學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下獨立進行研究工作所取得的成果除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外本論文不包含任何其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的作品成果對本文的研究做出重要貢獻的個人和集體均已在文中以明確方式標明本人完全意識到本聲明的法律結(jié)果由本人承擔學(xué)位論文作者簽名許莎瓊?cè)掌?006年1月10日3犬瘟熱病毒ELISA和RT-PCR檢測方法的研究摘要犬瘟熱CanineDis

2、temper是由犬瘟熱病毒CanineDistemperVirus,CDV引起犬和肉食目中許多動物的一種高度接觸性傳染病該病的傳染性強發(fā)病率高本病診斷比較困難傳統(tǒng)的檢測方法在靈敏性和特異性上存在一定局限性另外,在犬瘟熱弱毒疫苗廣泛應(yīng)用的背景下大多數(shù)犬的血清對犬瘟熱病毒呈陽性反應(yīng)犬瘟熱是對實驗用犬危害最大的病毒病之一建立現(xiàn)代實驗動物微生物學(xué)質(zhì)量監(jiān)測體系基本原則是對該病必須同時包括檢測病原體和檢測抗體兩個方面本實驗包括建立了檢測犬瘟熱病原體的RT-PCR方法和檢測抗體的ELISA方法兩種檢測方法互相補充綜合判定結(jié)果研究工作可分為2個部分第一部分犬瘟熱病毒間接E

3、LISA法檢測技術(shù)的建立與初步應(yīng)用采用RT-PCR法擴增出犬瘟熱病毒標準疫苗株的融合蛋白基因F基因片段約1499bp核衣殼蛋白基因N基因片段約825bp克隆到pMD18-T載體酶切鑒定后用一對特異性的引物擴增約732bp的F蛋白基因片段830bp的N蛋白基因片段這兩個基因定向克隆到原核表達載體pET-28a+中后重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主菌BL21中在371.0mMIPTG誘導(dǎo)下F蛋白基因N蛋白基因片段獲得了良好表達表達產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定結(jié)果顯示其表達的融合蛋白大小分別為28KDa33KDa與預(yù)期值相符誘導(dǎo)條件的改變IPTG的濃度改變對表達量影響不大We

4、stern印跡顯示表達產(chǎn)物能被CDV抗體特異性識別實驗結(jié)果表明這兩種重組蛋白保留了天然蛋白的部4分抗原性為進一步研究犬瘟熱病毒及其檢測方法奠定基礎(chǔ)利用pET-28a的HisTag使目的蛋白得到較好的純化簡易的棋盤滴定法確定抗原包被濃度F蛋白為10g/mlN蛋白5g/ml以此建立間接ELISA法用ELISA法檢測20份樣品血清兩種蛋白的檢測結(jié)果符合率為100%另外對血清做一系列濃度稀釋從中得出以F蛋白為抗原樣品血清的平均稀釋度為11025以N蛋白為抗原樣品血清的平均稀釋度為12630第二部分犬瘟熱病毒RT-PCR檢測方法的建立及初步應(yīng)用本研究通過特異性擴增C

5、DV核蛋白基因保守序列建立了檢測CDV核酸的RT-PCR法用NDVCPVPRVIBV進行特異性試驗結(jié)果顯示該方法有較好的特異性RT-PCR檢測的20份血樣中陽性陰性結(jié)果與臨床試紙法檢測結(jié)果相同而9份試紙檢測為可疑的樣品中有4份為陽性結(jié)果表明該方法的靈敏性與特異性較高本研究成功地建立了檢測樣品血清中CDV抗體的ELISA方法與檢測樣品中CDV抗原的RT-PCR方法為探索建立實驗動物微生物學(xué)質(zhì)量監(jiān)測體系打下基礎(chǔ)關(guān)鍵詞犬瘟熱病毒ELISART-PCR檢測方法5STUDYONDETECTIONOFCANINEDISTEMPERVIRUSBYELISAANDRT-P

6、CRABSTRATCaninedistempervirus(CDV)infectioncausesafrequentlyfatalsystemicdiseaseinabroadrangeofcarnivorespecies,withhighmorbidityandmortality.TraditionalmethodsforlaboratorydiagnosisofCaninedistemper(CD)arenotsufficientlysensitiveandspecific.Becauseofthewidespreaduseoftheattenuate

7、dvirusvaccine,mostofdog’sserumispositivetoCDV.CDisoneofthemostharmfulviraldiseasesforexperimentalanimals.Itisnecessarytodetecttheantigenandantibodyofdiseaseforestablishingthesystemofmicroorganismqualitymonitoringforexperimentalanimal.Inthisstudy,themethodofRT-PCRwasestablishedford

8、etectingtheantigenandELISAforthea