RNA體外干擾肝癌Hep3B細(xì)胞VEGF基因的表達(dá)

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1、RNA體外干擾肝癌Hep3B細(xì)胞VEGF基因的表達(dá)作者：蔣冬貴　夏昆　劉劫　羅紅　潘乾　龍志高　夏家輝【摘要】目的：通過自主構(gòu)建的RNAi載體和體外合成siRNA的方法，尋找能有效干擾VEGF基因表達(dá)的載體和siRNA片段治療腫瘤.方法：將自主構(gòu)建的pcDUVEGF1和pcDUVEGF2，以及體外合成的TWvegf1和TWvegf2siRNA片段轉(zhuǎn)染肝癌Hep3B細(xì)胞，通過RTPCR,WesternBlot和ELISA檢測轉(zhuǎn)染前后VEGF的mRNA及蛋白表達(dá)水平,以了解RNA干擾效果.結(jié)果：兩種RNA干

2、擾的方法均能抑制VEGF基因的表達(dá)且差異具有顯著性（mRNA,0.28，0.47，0.76，0.58vs1.2,P<0.01;蛋白質(zhì),138,121,249,227vs389μg/L,P<0.01）.結(jié)論：兩個(gè)質(zhì)粒及siRNA片段均能有效的抑制VEGF基因的表達(dá).【關(guān)鍵詞】RNAi；siRNA；血管內(nèi)皮生長因子；肝癌細(xì)胞　　　　【Abstract】AIM:ToconstructRNAiplasmidsandsynthesizesiRNAinvitro,transportthemintoHep3Bcel

3、ls,soastofindsomeeffectiveVEGFRNAiplasmidsandsiRNAsegments.METHODS:TheRNAiplasmidspcDUVEGF1,pcDUVEGF2andsiRNAsegmentsTWvegf1,TWvegf2weretransportedintoHep3Bcells,andtheexpressionsofVEGFmRNAandproteininthe8transfectedHep3BcellswerecheckedusingRTPCR,West

4、ernBlotandELISA.TheresultswerecomparedbetweenthetransfectedandthenormalHep3Bcells.RESULTS:TherewereprominentdifferencesbetweenthetwogroupsindepressingtheexpressionofmRNA(0.28,0.47,0.76,0.58vs1.2,P<0.01)andprotein(138,121,249,227vs389μg/L,P<0.01)ofVEGFge

5、ne.CONCLUSION:ThetwoRNAiplasmidsandsiRNAsegmentsinhibittheexpressionofVEGFgeneeffectively.　　【Keywords】RNAi;siRNA;VEGF;hepatocarcinoma　　0引言　　VEGF/VEGFR系統(tǒng)在惡性腫瘤中的協(xié)同表達(dá)，旁/自分泌作用機(jī)制的確立為腫瘤的臨床治療提供了新的靶點(diǎn).在哺乳動(dòng)物的細(xì)胞種發(fā)夾結(jié)構(gòu)的雙鏈RNA被剪切成siRNA，在體內(nèi)組裝成蛋白復(fù)合體，在siRNA的引導(dǎo)下Dicer酶切割靶RNA，或者以靶

6、RNA為模板合成新的雙鏈RNA，進(jìn)一步被Dicer識(shí)別和剪切,21ntsiRNA在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中可以誘導(dǎo)強(qiáng)有力的特異性RNAi作用［1-4］.我們使用自主構(gòu)建的RNAi真核基因表達(dá)載體pcDU6選擇特異的VEGF基因片段構(gòu)建VEGF基因的RNAi質(zhì)粒，選擇特異的VEGF基因片段體外合成21ntsiRNA，并將它們脂轉(zhuǎn)入肝癌Hep3B細(xì)胞后，通過RTPCR,WesternBlot和ELISA的方法檢測它們對(duì)VEGFmRNA和蛋白表達(dá)的抑制作用，以期找到可靠的抑制VEGF基因表達(dá)的質(zhì)粒和siRNA片段，為肝癌的基因

7、治療提供一種新的方法.8　　1材料和方法　　1.1材料　　設(shè)計(jì)合成兩段人U6promoter315至+1的PCR寡核苷酸引物從人的gDNA中擴(kuò)增出U6promoter（5′端增加BglII，3′增加ApaI的酶切位點(diǎn)）.將PCR產(chǎn)物用BglII和ApaI雙酶切后,再將pcDNA3.1(-)質(zhì)粒用BglII和ApaI雙酶切，構(gòu)建成RNAi質(zhì)粒pcDU6，構(gòu)建pcDU6的引物序列為正向：5′gcagatctacgcgcaggcaaaacgcacc,反向:5′ttgggcccggtgtttcgtcctttccac.根據(jù)

8、高效RNAi基因片段的設(shè)計(jì)原則［2］，我們?cè)O(shè)計(jì)并從上海博亞生物制品有限公司申請(qǐng)合成了構(gòu)建VEGF基因RNAi載體的寡核苷酸片段以及體外合成針對(duì)VEGF基因的siRNA的寡核苷酸片段，肝癌Hep3B細(xì)胞株購自CCTCC，非必需氨基酸（NAA）、丙酮酸鈉、胎牛血清、胰酶、EDTA,G418均購自Gibcol公司，RPMI1640干粉培養(yǎng)基購自Hyclone公司