人OAZ突變基因的克隆構(gòu)建及重組蛋白表達(dá)

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1、人OAZ突變基因的克隆構(gòu)建及重組蛋白表達(dá)作者：姜立馬文麗柯杰兵彭翼飛李晉徐兵鄭文嶺【摘要】目的構(gòu)建人鳥氨酸脫羧酶抗酶（OAZ）突變基因，重組至原核表達(dá)載體中并表達(dá)出重組蛋白。方法采用基因定點(diǎn)突變技術(shù)在OAZ基因TCCTGATG(199～206)位置造成第202位堿基T堿基缺失，使核糖體的閱讀框+1移位，連續(xù)表達(dá)OAZ基因的ORF2部分。測(cè)序鑒定后，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21菌，進(jìn)行突變基因的蛋白表達(dá)。結(jié)果重組質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序后確認(rèn)202位堿基T缺失，其余堿基序列無變化。重組的突變基因轉(zhuǎn)入BL21后在IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)OAZ

2、全長蛋白，SDS-PAGE分析在相對(duì)分子質(zhì)量45900左右出現(xiàn)新的蛋白條帶。結(jié)論成功構(gòu)建人OAZ突變基因重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化BL21后表達(dá)出融合的OAZ全長蛋白，為進(jìn)一步研究其臨床應(yīng)用打下基礎(chǔ)?！娟P(guān)鍵詞】鳥氨酸脫羧酶抗；突變；蛋白表達(dá)鳥氨酸脫羧酶（ornithinedecarboxylase，ODC）是多聚胺生物合成中的關(guān)鍵酶，催化多聚胺生物合成途徑中的第一步——鳥氨酸向腐胺的轉(zhuǎn)變。隨后，腐胺再轉(zhuǎn)變?yōu)閬喚?、精胺。ODC是該代謝途徑的限速酶，在此過程中扮演著重要的調(diào)控酶角色，其活性可在轉(zhuǎn)錄、翻譯和翻譯后水平受到精確的

3、調(diào)控。鳥氨酸脫羧酶抗酶（ornithinedecarboxylase8antizyme,OAZ）是在翻譯后水平的一種調(diào)控形式，它可以連接到ODC蛋白上，抑制其催化活性并靶向地促使26S蛋白酶降解ODC，從而負(fù)性調(diào)控細(xì)胞內(nèi)多聚胺含量。有研究表明，細(xì)胞內(nèi)OAZ的過度表達(dá)在降低細(xì)胞內(nèi)多胺水平的同時(shí)還能抑制細(xì)胞的生長。由此推測(cè)，OAZ在細(xì)胞的生長與分化過程中擔(dān)任著重要的角色［1~3］。OAZ蛋白的表達(dá)有一個(gè)非常有趣的移位翻譯現(xiàn)象，其表達(dá)受到精胺的一個(gè)稱之為frame-shifting的核糖體移位的調(diào)控。多聚胺通過這種較

4、罕見的調(diào)控機(jī)制誘導(dǎo)OAZ蛋白的生成，又反向抑制多聚胺在細(xì)胞內(nèi)的濃度，使細(xì)胞在一個(gè)穩(wěn)定的多聚胺水平進(jìn)行正常生長分化。OAZ轉(zhuǎn)錄本的編碼存在兩個(gè)不同的閱讀框，ORF1和ORF2。OAZ蛋白其實(shí)是一個(gè)由短的非保守的ORF1產(chǎn)物和高度保守的ORF2產(chǎn)物的組合。在OAZmRNA的閱讀框中，需要有一個(gè)+1的翻譯移碼過程。在ORF1的5′8端終止密碼子處，通常序列為TGCTCCTGATGCC(196~208)。翻譯框架達(dá)到TGA時(shí)，如果沒有精胺的存在，核糖體將接受TGA為終止密碼子，翻譯到此終止。當(dāng)精胺濃度一定時(shí)，核糖體的翻

5、譯即可受到精胺的調(diào)控進(jìn)行+1移碼，躍過終止密碼子TGA上的T，以GAT指導(dǎo)的天冬氨酸為后續(xù)，翻譯合成ORF2［4-5］。翻譯框架移碼受到細(xì)胞內(nèi)多聚胺水平上升的正調(diào)控，表達(dá)出的OAZ蛋白又能調(diào)節(jié)ODC的酶活性，反向調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)多聚胺的水平，從而影響到細(xì)胞的生長及分化。在生長旺盛的腫瘤組織中，普遍發(fā)現(xiàn)了ODC的高表達(dá)，因此，OAZ蛋白特有的調(diào)控ODC活性的功能，就使之成為腫瘤免疫治療的理想靶分子。但是，OAZ蛋白的表達(dá)受到精胺的誘導(dǎo)，缺乏精胺時(shí)，核糖體將不能進(jìn)行+1的移位，翻譯完整的全長OAZ蛋白。為此，本研究對(duì)OA

6、Z基因進(jìn)行了特定T堿基的缺失突變，成功構(gòu)建至表達(dá)載體pET-32a中，測(cè)序確認(rèn)后命名為pET-32a-OAZ-mutation，并在BL21菌中成功表達(dá)出OAZ全長蛋白，將對(duì)進(jìn)一步研究該基因的功能以及以O(shè)AZ為靶點(diǎn)的腫瘤核酸疫苗的制備，具有重要意義。1材料和方法1.1試劑大腸桿菌DH5α、BL21和表達(dá)質(zhì)粒pET-32a、pET-32a-OAZ-wild質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存。QuikChange定點(diǎn)突變?cè)噭┖匈徸許tratagene公司。質(zhì)粒純化試劑盒、膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、T4DNA連接酶、Xho

7、Ⅰ和EcoRⅠ內(nèi)切酶均購自TaKaRa公司，其余生化試劑均為國產(chǎn)分析純。引物根據(jù)OAZ基因所需點(diǎn)缺失堿基處進(jìn)行設(shè)計(jì)2條反向互補(bǔ)引物對(duì)P1與P2。P1：5′-CCTCGGTGGTGCTCCGATGCCCCTCACCC-3′；P2：5′-GGGTGAGGGGCATCGGAGCACCACCGAGG-3′。1.2方法1.2.1反向PCR擴(kuò)增以pET-32a-OAZ-wild質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR反應(yīng):將pET-32a-OAZ-wild質(zhì)粒(10mg/L)1μl、dNTP1μl、10×Buffer5μl、P1與P2引物(1

8、00mg/L)各2.5μl、PfuTurboDNA多聚酶(2.5×106U/L)1μl、雙蒸餾水37μl加入PCR管;95℃預(yù)變性30s后，95℃30s、55℃1min、68℃6min，共18個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物置于冰上2min,加入1.5μlDpnⅠ內(nèi)切酶(106U/L),37℃水浴2h，酶解模板DNA。1.2.2轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α取感受態(tài)大腸桿菌50μl,加入上述DpnⅠ處理液10