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《小鼠肝細(xì)胞AMPK相關(guān)microRNAs的篩選及功能研究》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、分類號(hào)：R587．1密級(jí)：學(xué)位類別：科學(xué)學(xué)位口專業(yè)學(xué)位囤冒學(xué)校代碼：10062學(xué)號(hào)：2010601099學(xué)科門類：醫(yī)學(xué)又坪眚科袁號(hào)博士學(xué)位論文DoCToRALDISSERTATIoN論文題目：小鼠肝細(xì)胞AMPK相關(guān)microRNAs的篩選及功能研究TITLEAMPK-relatedmicroRNAsexpressionprofileinmousehepatocytesandfunctionresearch一級(jí)學(xué)科：臨床醫(yī)學(xué)二級(jí)學(xué)科：內(nèi)科學(xué)內(nèi)分泌與代謝病論文作者：劉佳指導(dǎo)教師：張宏教授導(dǎo)師組成員：邸阜生主任醫(yī)師李紅濤主任醫(yī)師天津醫(yī)科大學(xué)研究生院
2、二。一三年五月學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所呈交的論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下獨(dú)立進(jìn)行研究工作取得的研究成果。除了文中特別加以標(biāo)注引用的內(nèi)容和致謝的地方外，論文中不包含任何其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意。學(xué)位論文作者簽名：學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書日期p哆年，肛日本學(xué)位論文作者完全了解天津醫(yī)科大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：學(xué)校有權(quán)將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，并采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編以供查閱和借閱。同意學(xué)校向國家
3、有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文，并編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫。保密口，在——年解密后適用本授權(quán)書。本論文屬于不保密函。(請?jiān)谙鄬?yīng)的方框內(nèi)打“√”)學(xué)位論文作者簽名：導(dǎo)師簽名：Et期：為／弓年廠月M日日期：勵(lì)；釘鋤日天津醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文中文摘要目的：腺苷酸活化蛋白激酶(adenosinemonophosphate—activatedproteinkinase，AMPK)是細(xì)胞適應(yīng)環(huán)境和營養(yǎng)變化的核心，肝臟是碳水化合物儲(chǔ)存和釋放最重要的器官。microRNAs(miRNAs)是一組新發(fā)現(xiàn)的小分子RNA，幾乎可以作用于機(jī)體包括能量代謝的各個(gè)重要的生命過程。本研究
4、擬篩選小鼠肝細(xì)胞中參與AMPK信號(hào)傳導(dǎo)途徑的miRNAs，通過生物信息學(xué)方法尋找可能參與AMPK對能量代謝有調(diào)控作用的miRNAs，預(yù)測其靶基因及可能的生物學(xué)功能，并進(jìn)一步驗(yàn)證其在AMPK調(diào)節(jié)肝糖代謝中發(fā)揮的作用。方法：1．肝細(xì)胞AMPK相關(guān)miRNAs的篩選：雄性C57BL／6小鼠原代肝細(xì)胞體外培養(yǎng)，雙丁酰環(huán)腺苷酸(dibutyryl—cyclicadenosinemonophosphate，Btz·cAMP)干預(yù)作為Bt2一cAMP組，實(shí)驗(yàn)組再加入不同濃度(O．125mM、0．25raM、0．5mM、lmM)的5．氨基咪唑．4．甲酰胺．1
5、-B．D．呋哺核糖苷(5-aminoimidazole．4．carboxamide．1．B．d．ribofuranoside，AICAR)干預(yù)，westernblotting方法檢測AMPK、環(huán)腺苷一磷酸反應(yīng)元件結(jié)合蛋白調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄共激活子2(cyclicadenosinemonophosphate-responseelementbindingprotein-regulatedtranscriptioncoactivator2，CRTC2)蛋白及其磷酸化水平的表達(dá)，PCR方法檢測過氧化物酶體增殖物激活受體7共激活因子la(peroxisomepr
6、oliferator-activatedreceptor-1，coaetivator-10t，PGC—la)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvatecarboxykinase，PEPCK)和葡萄糖．6．磷酸酶(glucose．6-phosphase，G6pase)基因的表達(dá)；選擇合適的AICAR濃度，Bt2．cAMP組為對照組進(jìn)行miRNAs芯片檢測兩組細(xì)胞miRNAs譜的差異。2．AMPK相關(guān)miRNAs的生物信息學(xué)分析：Targetscan網(wǎng)站對芯片結(jié)果中變化超過2倍的miRNAs分成上調(diào)和下調(diào)的兩組分別進(jìn)行靶基因
7、預(yù)測，F(xiàn)unDo分析靶基因與疾病的關(guān)系。選擇在肝臟中表達(dá)豐富、AICAR干預(yù)后變化顯著的miRNA，應(yīng)用多個(gè)靶基因預(yù)測網(wǎng)站再次進(jìn)行靶基因預(yù)測，推測其在AMPK對肝糖代謝的調(diào)節(jié)過程中可能發(fā)揮的作用。3．miR-29參與AMPK信號(hào)途徑對肝糖異生的調(diào)節(jié)：realtimePCR方法檢測AICAR干預(yù)后miR．29家族、靶基因p85a和糖異生相關(guān)基因PEPCK、G6pase天津醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文的表達(dá)；設(shè)計(jì)構(gòu)建miR-29家族模擬物，轉(zhuǎn)染小鼠原代肝細(xì)胞，轉(zhuǎn)染成功后，PCR方法檢測p85tx和PEPCK、G6pase基因的表達(dá)，westernblot
8、ting方法檢測p85a蛋白的表達(dá)；進(jìn)一步在禁食14h小鼠及正常進(jìn)食的對照小鼠肝臟中檢測miR．29家族、p85et基因和蛋白的表達(dá)，觀察不同狀態(tài)下AMPK對miR
