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《含HIV1+env基因的質(zhì)粒DNA及重組腺病毒載體疫苗的研究》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、摘要摘要自從上世紀(jì)80年代發(fā)現(xiàn)HIV以來，科學(xué)家一直在進"：『yHIV疫苗的研究，但是由于HIV高度的基因變異性和其獨特的特性，直到現(xiàn)在仍然沒有有效的疫苗問世，HIV給人類醫(yī)學(xué)帶來了巨大的挑戰(zhàn)。研制出一種安全、有效、價廉的艾滋病疫苗來預(yù)防控制艾滋病的傳播迫在眉睫。本研究的目的是分析河南地區(qū)有償獻血者HIV．1el'Iv基因序列，對獲得的共有序列進行基因優(yōu)化；構(gòu)建含密碼子優(yōu)化的gpl60共有序列的質(zhì)粒DNA疫苗和重組腺病毒疫苗，期望兩種疫苗聯(lián)合應(yīng)用能誘導(dǎo)高水平的細胞免疫反應(yīng)和有中和作用的保護抗體。本文首先應(yīng)用套式聚合酶鏈反應(yīng)(nested．PC
2、R)從60例河南省HIV．1抗體陽性有償獻血者外周血單個核細胞DNA樣品中擴增全長erlv基因，將擴增的基因連接至r]pGEM．T載體上進行序列測定。共擴增至tJ21個全長eYl'g基因，序列分析發(fā)現(xiàn)其中15個el,Iv基因有完整的開放讀碼框(ORF)，14個為B’亞型，與國際參考株RL42的基因離散率為4．87％+0．31％，1個為B亞型，與國際參考株HXB2的基因離散率為5．43％。根據(jù)核苷酸序列推導(dǎo)出相應(yīng)的氨基酸序列，并對重要的功能結(jié)構(gòu)域進行了深入的分析和比較。發(fā)現(xiàn)15個序列的N糖基化位點和數(shù)目沒有顯著變化；CD4受體結(jié)合位點高度保守；
3、根據(jù)V3環(huán)氨基酸序列及靜電荷數(shù)目預(yù)測13分離株使用CCR5輔助受體，2個分離株使用CXCR4輔助受體；V3環(huán)四肽序列以GPGR這一典型歐美B亞型最多，占40％；Gpl20／Gp4l剪切位點高度保守，預(yù)測所有Gpl60前體都能有效剪切；2G12、IgGlbl2、4E10及2F5四種廣譜中和抗體識別位點高度保守，表明大多數(shù)分離株對上述中和抗體敏感。按照人類密碼子使用頻率表對來源于上述15個具有完整開放讀碼框的gpl60基因的共有序列進行優(yōu)化并全基因合成。把優(yōu)化后的基因構(gòu)建到質(zhì)粒pVR中獲得了DNA疫苗，WesternBlot檢測發(fā)現(xiàn)優(yōu)化后的gpl
4、60基因能很好的表達。同時也將優(yōu)化的基因構(gòu)建到重組腺病毒的穿梭質(zhì)粒pDC316中，并和骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細胞包裝出攜帶gpl60基因的重組腺病毒疫苗。gpl60基因同樣能在rAdV疫苗中有效表達。將DNA疫苗，重組腺病毒疫苗單獨和聯(lián)合免疫小鼠，分別用ELISPOT和ELIISA檢測小鼠的細胞免疫反應(yīng)和體液免疫反應(yīng)。在細胞免疫方面，在最后一次免疫后l周時以DNA疫苗初免，rAdV疫苗加強免疫誘導(dǎo)的細胞免疫反應(yīng)最強(296SFC／2×105PBMCs)，但是隨著時間的推移細胞免疫反應(yīng)大幅度的降低；而DNA單獨免疫引起的細胞免疫反應(yīng)在最后一次免疫
5、后l周時稍弱，但到4周后由于其誘導(dǎo)的細胞免疫反應(yīng)下降緩慢，和其它組相比則最強。在體液免疫反應(yīng)方面，DNA疫苗，腺病毒疫苗單獨及聯(lián)合免疫誘導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)都很低，其中rAdV疫苗單獨免疫效果優(yōu)于其它各組，在最后一次免疫后1周和4周時rAdV疫苗單獨免疫組OD450／630均值分別為0．4084(1：100稀釋血清)和0．8645(1：400稀釋血清)。北京工業(yè)大學(xué)理學(xué)碩士學(xué)位論文]．II：1
6、曼曼蔓曼!曼曼鼉!曼曼!曼苧!!曼曼曼!!曼!!曼!!曼曼曼!!皇!!曼曼!皇!!!曼!曼曼皇曼曼皇!曼曼曼曼曼曼鼉!曼!曼我們的數(shù)據(jù)表明攜帶Env蛋白的
7、DNA和rAdV疫苗可以誘導(dǎo)出很高的細胞免疫反應(yīng)，但是很難誘導(dǎo)出高水平的體液免疫反應(yīng)，尤其是具有中和作用的抗體。因此，繞過抗原免疫而直接用基因治療載體在體內(nèi)表達具有廣譜中和作用的抗體可能是一種比較好的疫苗設(shè)計思路，目前我們正在進行這方面的探索。關(guān)鍵詞HIV．1；gpl60；rAdV；細胞免疫反應(yīng)；體液免疫反應(yīng)VABSTRACTScientistshavebeenfocusingonthestudyofHIVvaccinessinceHIVwasidentifiedin1980’S．However，theenormrousgeneticdive
8、rsityandotheruniquefeatureoftheHIVhavethusfarthwartedattemptstoidentifyaneffectivecandidatevaccine．ThedevelopmentofanHIVvaccineposesallunprecedentedchallengetothescientificcommunity．Asafe，effectiveandaccessibleHIVvaccineiSurgentlyneededtocontrolandpreventtheprevalenceofHIV．
9、ThemainobjectivesofourstudiesaregeneticanalysisofthecompleteenygenesofHIV一1frompai
